EGCG減輕大鼠脊髓損傷后脊髓水腫的作用機制研究.pdf

1、脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是脊柱外科最嚴重的致殘性疾病之一。隨著建筑業(yè)、交通業(yè)及體育運動等不斷發(fā)展，SCI發(fā)生率逐年增多，且以青壯年多發(fā)，對患者的健康和生命構(gòu)成了嚴重的威脅。脊髓損傷后通常伴有脊髓水腫，且脊髓水腫程度嚴重影響脊髓損傷的療效。因此，減輕脊髓水腫是治療脊髓損傷的一種良策。目前治療脊髓損傷的藥物主要是大劑量的甲基強的松龍，但是大劑量沖擊治療會引起消化道出血、敗血癥、肺炎、傷口感染等并發(fā)癥。因此，尋

2、找療效更好、使用更加安全的藥物成為近年來研究治療脊髓損傷的熱點和難點問題。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin Gallate，EGCG)是綠茶中的主要活性成分，對正常人體幾乎無毒害作用，大量研究證實其具有抗癌、抗氧化、抗炎癥等作用。另外，EGCG在治療和干預神經(jīng)系統(tǒng)疾病上也具有良好的神經(jīng)保護作用。最近一些研究證實EGCG能夠減輕大鼠脊髓損傷后神經(jīng)細胞的凋亡，改善運動功能。然而，EGCG能否減輕脊髓損傷引起的脊髓水

3、腫未見報道。我們通過本項研究探討EGCG是否具有減輕脊髓損傷后脊髓水腫的作用，并探討EGCG對減輕脊髓損傷后脊髓水腫的可能作用機制。
　　 目的：
　　 通過觀察大鼠脊髓損傷后各組脊髓組織含水量的變化，檢驗EGCG是否具有減輕脊髓損傷后脊髓水腫的作用。用免疫組化以及Western blot方法觀察水通道蛋白4(AQP4)及膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)在大鼠急性脊髓損傷后的變化規(guī)律，進一步觀察給予EGCG注射治療后AQP4

4、和GFAP表達的變化情況，探討EGCG是否通過調(diào)節(jié)AQP4和GFAP的表達而調(diào)控脊髓損傷后脊髓水腫。
　　 方法：
　　 造模:成年雄性SD大鼠150只，體重210-230克，大鼠被隨機分為假手術(shù)組，損傷對照組，EGCG治療組。大鼠麻醉后，以胸12棘突為中心逐層切開皮膚、皮下及肌肉，顯露胸11～13棘突及椎板。咬除胸12棘突及全椎板至椎弓根部，暴露硬脊膜并保持其完整性，將動脈夾的兩個夾片分別插入胸12水平脊髓硬膜前后緣之

5、間，直視下確保動脈夾完全通過脊髓。夾閉動脈夾，1分鐘后取出動脈夾，逐層縫合。假手術(shù)組只暴露脊髓，不損傷脊髓，其余步驟相同。
　　 給藥:假手術(shù)組及損傷對照組手術(shù)后立即腹腔注射生理鹽水，術(shù)后24小時及48小時分別再次腹腔注射生理鹽水;EGCG治療組手術(shù)后立即腹腔注射EGCG(100mg/kg)，術(shù)后24小時及48小時分別再次腹腔注射EGCG(100mg/kg)。
　　 取材:術(shù)后各時間點各組取5只大鼠進行干濕重檢測，5只進

6、行Western blot檢測。利刀切取損傷節(jié)段脊髓1厘米進行干濕重或WB檢測。術(shù)后24小時及72小時各組取5只大鼠進行免疫組化檢測，以生理鹽水及4％多聚甲醛心臟灌注后，利刀切取損傷節(jié)段脊髓1厘米，放入4％多聚甲醛液中繼續(xù)固定24小時，常規(guī)進行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，切片位置為損傷中心近端3毫米，片厚10微米。
　　 檢測方法:1.脊髓組織含水量檢測。電子天平分別稱取各組脊髓組織的濕重，然后將組織置于80℃干燥箱48小時至

7、恒重后稱取脊髓組織干重，脊髓含水量根據(jù)如下公式計算:（濕重-千重）/濕重×100％。2.免疫組化法觀察各組術(shù)后24小時和72小時AQP4和GFAP陽性細胞的表達情況。采用過氧化物酶標記的鏈霉卵白素(SP)法進行免疫組化檢測。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3％過氧化氫室溫孵育15分鐘以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，微波抗原修復10分鐘，正常山羊血清封閉非特異性結(jié)合位點，室溫孵育30分鐘，傾去血清，滴加一抗4℃過夜（兔抗大鼠AQP4多克隆抗體，1(∶

8、)100;小鼠抗大鼠GFAP單克隆抗體，1(∶)500）。第二日滴加生物素標記二抗（羊抗兔或小鼠）室溫孵育30分鐘，滴加辣根酶標記鏈霉卵蛋白素室溫孵育15分鐘，滴加DAB顯色劑顯色，蘇木素輕度復染細胞核。計數(shù)各組陽性細胞數(shù)。3.Western blot法檢測各時間點AQP4和GFAP表達量的變化。脊髓組織放入RIPA細胞裂解液中裂解，以BCA法測定蛋白濃度，常規(guī)進行電泳及轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出PVDF膜室溫置于5％脫脂奶粉封閉2小時。加

9、適量一抗（AQP4多克隆抗體1(∶)400，GFAP單克隆抗體1(∶)150，β-actin1(∶)2000）4℃過夜。第二日將PVDF膜放入塑料袋中，加入適量二抗室溫孵育2小時，滴加顯影劑與PVDF膜充分接觸，用電泳凝膠成像分析系統(tǒng)顯示AQP4、GFAP、β-actin條帶，Image J軟件進行灰度值分析。
　　 統(tǒng)計學分析:實驗數(shù)據(jù)采用（平均數(shù)±標準差）表示，用SPSS16軟件進行統(tǒng)計學分析，采用單因素方差分析ANOVA檢

10、驗。以P＜0.05作為差異有統(tǒng)計學意義的檢驗標準。
　　 結(jié)果：
　　 (1)術(shù)后各時間點假手術(shù)組脊髓組織含水量較低，損傷對照組含水量明顯增高，與假手術(shù)組比較，損傷后12小時，24小時，48小時，72小時均明顯增高(P＜0.05)。與損傷對照組比較，EGCG治療組脊髓組織含水量在損傷后12小時無顯著性差別(P＞0.05)，在損傷后24小時，48小時和72小時脊髓組織含水量均明顯下降(P＜0.05)。
　　 (2)

11、免疫組化檢測結(jié)果顯示AQP4主要表達于灰質(zhì)中，尤其富集于毛細血管周圍的膠質(zhì)細胞中。在傷后24小時和72小時，與假手術(shù)組相比，損傷對照組AQP4陽性細胞數(shù)明顯增多，與損傷對照組相比，EGCG治療組能夠明顯降低AQP4陽性細胞數(shù)。Western blot檢測顯示損傷對照組各時間點AQP4蛋白表達均明顯增高。和損傷對照組相比，在傷后24小時，48小時和72小時，EGCG治療組AQP4蛋白表達水平均顯著下降，而在傷后12小時，兩組AQP4蛋白表

12、達無明顯差異。
　　 (3)免疫組化檢測結(jié)果顯示在術(shù)后24小時和72小時與假手術(shù)組相比，損傷對照組GFAP陽性細胞明顯增加，與損傷對照組相比，EGCG治療組GFAP陽性細胞數(shù)明顯下降。Western blot結(jié)果顯示在傷后12小時，24小時，48小時和72小時，損傷對照組GFAP水平較假手術(shù)組明顯增高，而在傷后24小時，48小時和72小時，EGCG治療組GFAP蛋白表達水平較損傷對照組顯著下降，而在傷后12小時，損傷對照組與EG