版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認領
文檔簡介
1、脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是脊柱外科最嚴重的致殘性疾病之一。隨著建筑業(yè)、交通業(yè)及體育運動等不斷發(fā)展,SCI發(fā)生率逐年增多,且以青壯年多發(fā),對患者的健康和生命構(gòu)成了嚴重的威脅。脊髓損傷后通常伴有脊髓水腫,且脊髓水腫程度嚴重影響脊髓損傷的療效。因此,減輕脊髓水腫是治療脊髓損傷的一種良策。目前治療脊髓損傷的藥物主要是大劑量的甲基強的松龍,但是大劑量沖擊治療會引起消化道出血、敗血癥、肺炎、傷口感染等并發(fā)癥。因此,尋
2、找療效更好、使用更加安全的藥物成為近年來研究治療脊髓損傷的熱點和難點問題。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin Gallate,EGCG)是綠茶中的主要活性成分,對正常人體幾乎無毒害作用,大量研究證實其具有抗癌、抗氧化、抗炎癥等作用。另外,EGCG在治療和干預神經(jīng)系統(tǒng)疾病上也具有良好的神經(jīng)保護作用。最近一些研究證實EGCG能夠減輕大鼠脊髓損傷后神經(jīng)細胞的凋亡,改善運動功能。然而,EGCG能否減輕脊髓損傷引起的脊髓水
3、腫未見報道。我們通過本項研究探討EGCG是否具有減輕脊髓損傷后脊髓水腫的作用,并探討EGCG對減輕脊髓損傷后脊髓水腫的可能作用機制。
目的:
通過觀察大鼠脊髓損傷后各組脊髓組織含水量的變化,檢驗EGCG是否具有減輕脊髓損傷后脊髓水腫的作用。用免疫組化以及Western blot方法觀察水通道蛋白4(AQP4)及膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)在大鼠急性脊髓損傷后的變化規(guī)律,進一步觀察給予EGCG注射治療后AQP4
4、和GFAP表達的變化情況,探討EGCG是否通過調(diào)節(jié)AQP4和GFAP的表達而調(diào)控脊髓損傷后脊髓水腫。
方法:
造模:成年雄性SD大鼠150只,體重210-230克,大鼠被隨機分為假手術(shù)組,損傷對照組,EGCG治療組。大鼠麻醉后,以胸12棘突為中心逐層切開皮膚、皮下及肌肉,顯露胸11~13棘突及椎板。咬除胸12棘突及全椎板至椎弓根部,暴露硬脊膜并保持其完整性,將動脈夾的兩個夾片分別插入胸12水平脊髓硬膜前后緣之
5、間,直視下確保動脈夾完全通過脊髓。夾閉動脈夾,1分鐘后取出動脈夾,逐層縫合。假手術(shù)組只暴露脊髓,不損傷脊髓,其余步驟相同。
給藥:假手術(shù)組及損傷對照組手術(shù)后立即腹腔注射生理鹽水,術(shù)后24小時及48小時分別再次腹腔注射生理鹽水;EGCG治療組手術(shù)后立即腹腔注射EGCG(100mg/kg),術(shù)后24小時及48小時分別再次腹腔注射EGCG(100mg/kg)。
取材:術(shù)后各時間點各組取5只大鼠進行干濕重檢測,5只進
6、行Western blot檢測。利刀切取損傷節(jié)段脊髓1厘米進行干濕重或WB檢測。術(shù)后24小時及72小時各組取5只大鼠進行免疫組化檢測,以生理鹽水及4%多聚甲醛心臟灌注后,利刀切取損傷節(jié)段脊髓1厘米,放入4%多聚甲醛液中繼續(xù)固定24小時,常規(guī)進行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片,切片位置為損傷中心近端3毫米,片厚10微米。
檢測方法:1.脊髓組織含水量檢測。電子天平分別稱取各組脊髓組織的濕重,然后將組織置于80℃干燥箱48小時至
7、恒重后稱取脊髓組織干重,脊髓含水量根據(jù)如下公式計算:(濕重-千重)/濕重×100%。2.免疫組化法觀察各組術(shù)后24小時和72小時AQP4和GFAP陽性細胞的表達情況。采用過氧化物酶標記的鏈霉卵白素(SP)法進行免疫組化檢測。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,3%過氧化氫室溫孵育15分鐘以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性,微波抗原修復10分鐘,正常山羊血清封閉非特異性結(jié)合位點,室溫孵育30分鐘,傾去血清,滴加一抗4℃過夜(兔抗大鼠AQP4多克隆抗體,1(∶
8、)100;小鼠抗大鼠GFAP單克隆抗體,1(∶)500)。第二日滴加生物素標記二抗(羊抗兔或小鼠)室溫孵育30分鐘,滴加辣根酶標記鏈霉卵蛋白素室溫孵育15分鐘,滴加DAB顯色劑顯色,蘇木素輕度復染細胞核。計數(shù)各組陽性細胞數(shù)。3.Western blot法檢測各時間點AQP4和GFAP表達量的變化。脊髓組織放入RIPA細胞裂解液中裂解,以BCA法測定蛋白濃度,常規(guī)進行電泳及轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,取出PVDF膜室溫置于5%脫脂奶粉封閉2小時。加
9、適量一抗(AQP4多克隆抗體1(∶)400,GFAP單克隆抗體1(∶)150,β-actin1(∶)2000)4℃過夜。第二日將PVDF膜放入塑料袋中,加入適量二抗室溫孵育2小時,滴加顯影劑與PVDF膜充分接觸,用電泳凝膠成像分析系統(tǒng)顯示AQP4、GFAP、β-actin條帶,Image J軟件進行灰度值分析。
統(tǒng)計學分析:實驗數(shù)據(jù)采用(平均數(shù)±標準差)表示,用SPSS16軟件進行統(tǒng)計學分析,采用單因素方差分析ANOVA檢
10、驗。以P<0.05作為差異有統(tǒng)計學意義的檢驗標準。
結(jié)果:
(1)術(shù)后各時間點假手術(shù)組脊髓組織含水量較低,損傷對照組含水量明顯增高,與假手術(shù)組比較,損傷后12小時,24小時,48小時,72小時均明顯增高(P<0.05)。與損傷對照組比較,EGCG治療組脊髓組織含水量在損傷后12小時無顯著性差別(P>0.05),在損傷后24小時,48小時和72小時脊髓組織含水量均明顯下降(P<0.05)。
(2)
11、免疫組化檢測結(jié)果顯示AQP4主要表達于灰質(zhì)中,尤其富集于毛細血管周圍的膠質(zhì)細胞中。在傷后24小時和72小時,與假手術(shù)組相比,損傷對照組AQP4陽性細胞數(shù)明顯增多,與損傷對照組相比,EGCG治療組能夠明顯降低AQP4陽性細胞數(shù)。Western blot檢測顯示損傷對照組各時間點AQP4蛋白表達均明顯增高。和損傷對照組相比,在傷后24小時,48小時和72小時,EGCG治療組AQP4蛋白表達水平均顯著下降,而在傷后12小時,兩組AQP4蛋白表
12、達無明顯差異。
(3)免疫組化檢測結(jié)果顯示在術(shù)后24小時和72小時與假手術(shù)組相比,損傷對照組GFAP陽性細胞明顯增加,與損傷對照組相比,EGCG治療組GFAP陽性細胞數(shù)明顯下降。Western blot結(jié)果顯示在傷后12小時,24小時,48小時和72小時,損傷對照組GFAP水平較假手術(shù)組明顯增高,而在傷后24小時,48小時和72小時,EGCG治療組GFAP蛋白表達水平較損傷對照組顯著下降,而在傷后12小時,損傷對照組與EG
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 大鼠急性脊髓損傷后肺水腫的機制及黃芪多糖對肺水腫的保護作用的初步研究.pdf
- 中藥“脊髓康”對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)元的保護作用及機制研究.pdf
- 維甲酸對大鼠急性脊髓損傷后血脊髓屏障保護作用及其機制研究.pdf
- EGb761對大鼠急性脊髓損傷后血—脊髓屏障的保護作用及其機制研究.pdf
- 大鼠脊髓損傷后脊髓水腫與水通道蛋白4(AQP-4)表達變化的研究.pdf
- 丙戊酸對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)修復作用及其機制的研究.pdf
- PDGF對大鼠脊髓損傷后保護作用的初步研究.pdf
- Propentofylline對大鼠脊髓損傷后的神經(jīng)保護作用及其機制的研究.pdf
- 大鼠脊髓損傷后β淀粉樣蛋白的表達變化及作用機制研究.pdf
- 脊髓康對大鼠脊髓損傷后軸突再生微環(huán)境的作用機制研究.pdf
- 大鼠脊髓損傷后自噬的變化及EGCG對其影響的實驗研究.pdf
- MSK1在大鼠脊髓損傷后修復中的作用和機制研究.pdf
- 紅花對大鼠急性脊髓損傷后保護機制的實驗研究.pdf
- NT-3對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)細胞凋亡及脊髓損傷修復的作用.pdf
- 隔日限食療法對大鼠急性脊髓損傷后神經(jīng)保護作用的機制研究.pdf
- 白藜蘆醇對脊髓損傷大鼠脊髓及遠隔臟器的保護作用及機制研究.pdf
- 異氟烷對脊髓損傷大鼠神經(jīng)源性肺水腫的影響及其作用機制的研究.pdf
- 大鼠脊髓損傷后血-脊髓屏障的變化及其與繼發(fā)性損傷關(guān)系的研究.pdf
- 表皮生長因子對脊髓損傷后血脊髓屏障的保護作用及其機制研究.pdf
- IL-6在大鼠脊髓損傷后再生中的作用.pdf
評論
0/150
提交評論