高遷移率族蛋白B1對燙傷延遲復(fù)蘇大鼠T淋巴細(xì)胞功能的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：高遷移率族蛋白B1(HMGB1)作為一種晚期炎癥介質(zhì)，介導(dǎo)了膿毒癥和其他系統(tǒng)性炎癥的致死性。本試驗(yàn)擬應(yīng)用大鼠燙傷延遲復(fù)蘇模型明確HMGB1在嚴(yán)重燙傷中的表達(dá)變化規(guī)律，進(jìn)而闡明HMGB1對細(xì)胞免疫功能的影響并對其機(jī)制進(jìn)行初步探討。旨在為燙傷后膿毒癥及多器官功能障礙綜合征的預(yù)防和治療提供新思路。 方法：采用30％TBSAⅢ度燙傷后延遲6小時(shí)復(fù)蘇大鼠模型。雄性Wistar大鼠103只，隨機(jī)分為：①正常對照組(n=7)，麻醉后活殺

2、；②假燙傷組(n=32)，分別在假燙傷后1、3、5、7天后活殺；③燙傷組(n=32)，在燙傷后6小時(shí)給予林格氏液(40ml/kg)抗休克治療，此外在燙傷后12、24、36、48小時(shí)分別給予3ml/次林格氏液腹腔內(nèi)注射，在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)活殺；④EP液(3.23mg/ml)治療組(n=32)，于燙傷后6小時(shí)EP液(40ml/kg)抗休克治療，此外在燙傷后12、24、36、48小時(shí)分別給予3ml/次EP液腹腔內(nèi)注射治療，在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)活殺。無菌取腹

3、主動(dòng)脈血及脾臟。離心取血漿，應(yīng)用ELISA分析血漿中IL-2及sIL-2R含量。脾臟分為兩部分：一部分應(yīng)用RT-PCR檢測HMGB1、IL-2、IL-2R基因的表達(dá)及應(yīng)用凝膠電泳遷移率改變分析法(EMSA)分析活化T-細(xì)胞核因子(NFAT)活性。另一部分脾臟用于脾淋巴細(xì)胞分離，應(yīng)用MTT技術(shù)分析淋巴細(xì)胞增值，應(yīng)用ELISA分析培養(yǎng)上清中IL-2、IL-4及IFN-γ含量，應(yīng)用細(xì)胞流式技術(shù)檢測脾淋巴細(xì)胞白介素2膜受體(mIL-2R)的表達(dá)

4、、細(xì)胞周期及淋巴細(xì)胞的凋亡。 結(jié)果：1.燙傷延遲復(fù)蘇后HMGB1分泌及mRNA表達(dá)規(guī)律：(1)與假燙傷組相比，燙傷1、3、5天血漿HMGB1水平顯著升高(P＜0.05或P＜0.01)。EP治療組1、3、5天血漿HMGB1顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)，至燙傷后第7天無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。(2)燙傷組1、3天HMGB1的基因表達(dá)量明顯增加，其中燙傷后第一天升高最為顯著(P＜0.01)。但應(yīng)用EP治療后并沒有降低HM

5、GB1mRNA的表達(dá)。2.HMGB1對大鼠脾淋巴細(xì)胞增殖、IL-2生成及淋巴細(xì)胞功能性極化的影響：(1)在燙傷延遲復(fù)蘇后1-7天中，脾淋巴細(xì)胞對絲裂原(ConA)刺激的增殖反應(yīng)明顯受抑制(P＜0.05或P＜0.01)。同時(shí)觀察到，在燙傷后1-5天中脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-2的能力明顯下降(P＜0.05)。在燙傷早期(1、3天)，脾淋巴細(xì)胞表達(dá)IL-2R明顯下降(P＜0.05)，但是隨著時(shí)間的推移，動(dòng)物從創(chuàng)傷中逐漸恢復(fù)，IL-2R表達(dá)逐漸回升

6、至正常范圍。給予EP治療能夠明顯改善燙傷1-7天內(nèi)脾淋巴細(xì)胞對絲裂原刺激的增殖能力(P＜0.05)。同燙傷組比較，EP能夠顯著增加燙傷后1-5天脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-2的能力(P＜0.05)。(2)燙傷后1-7天中，血漿sIL-2R水平明顯增加(P＜0.05)，而EP治療對sIL-2R的含量無明顯影響。(3)嚴(yán)重燙傷能夠明顯抑制絲裂原刺激所致的細(xì)胞周期由G1期向G2+S期轉(zhuǎn)移，其中在燙傷1、3天尤為明顯(P＜0.05)。應(yīng)用EP進(jìn)行干預(yù)使

7、得燙傷第1天淋巴細(xì)胞由G1期進(jìn)入G2+S期的細(xì)胞比例明顯增加(P＜0.05)。(4)嚴(yán)重燙傷后脾淋巴細(xì)胞對于絲裂原刺激產(chǎn)生IL-4的能力明顯增加，尤以1、3天為明顯(P＜0.05)。相反，燙傷后3、5、7天與假燙傷組比較，IFN-γ產(chǎn)生的能力明顯下降(P＜0.05)。而EP治療后1、3天脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-4含量明顯降低。EP治療1、3、5天能夠明顯增加IFN-γ含量(P＜0.05)。3.HMGB1對大鼠脾T淋巴細(xì)胞凋亡、IL-2

8、mRNA表達(dá)及信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制的影響：(1)在燙傷后1天，脾CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞的凋亡明顯增加(P＜0.05)。給予EP阻斷HMGB1釋放后，能夠明顯降低燙傷后1天脾CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞的凋亡(P＜0.05)。(2)實(shí)驗(yàn)研究顯示，IL-2mRNA表達(dá)在燙傷后1-7天明顯降低(P＜0.05)，而應(yīng)用EP治療后燙傷1、3天IL-2mRNA表達(dá)明顯升高(P＜0.05)。而IL-2RmRNA表達(dá)在燙傷及治療組之間無明顯差異(P＞0.05

9、)。(3)燙傷后1、3天的NFAT結(jié)合活性顯著降低(P＜0.05)，應(yīng)用HMGB1抑制劑后能夠明顯提高NFAT的結(jié)合活性。 結(jié)論：1.燙傷延遲復(fù)蘇可以促進(jìn)HMGB1合成釋放及基因表達(dá)，其動(dòng)力學(xué)變化規(guī)律體現(xiàn)了HMGB1產(chǎn)生較晚、下降緩慢的“晚期炎癥介質(zhì)，，特點(diǎn)。2.燙傷早期HMGB1的過度釋放與脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)抑制、IL-2生成減少、IL-2R表達(dá)降低及細(xì)胞周期由G1期向G2+S期轉(zhuǎn)移抑制有關(guān)，進(jìn)而證實(shí)HMGB1與燙傷早期機(jī)體細(xì)