高遷移率族蛋白B1對小鼠調節(jié)性樹突狀細胞免疫功能影響的實驗研究.pdf

1、目的：高遷移率族蛋白B1（HMGB1）作為一種晚期炎癥介質，介導了膿毒癥和其他全身炎癥的致死性效應，研究其病理生理作用與意義將有助于深化對膿毒癥發(fā)病機制的認識，并為免疫反應的調控提供潛在的干預目標。本實驗擬采用HMGB1體外刺激小鼠脾臟調節(jié)性樹突狀細胞（DCreg），重點圍繞HMGB1對DCreg免疫功能的影響及其受體機制進行初步探討，旨在為膿毒癥及多器官功能障礙綜合征的預防和治療提供新思路。
　　方法：1.分離培養(yǎng)正常Balb/

2、c小鼠脾臟DCreg（CD11clowCD45RBhighDCs），采用不同劑量的HMGB1（10、100、1000ng/ml）刺激12小時，并以100ng/mlHMGB1于不同時間點（2、12、24小時）刺激，觀察HMGB1刺激與DCreg分泌白細胞介素（IL）-10和IL-12水平、表面共刺激分子CD40、CD80、CD86和主要組織相容性復合物（MHC）-II表達的劑量-效應關系及時間-效應關系。采用ELISA法檢測上清中IL-1

3、0和IL-12水平，DCreg共刺激分子表達采用流式細胞儀分析。2.DCreg經100ng/ml的HMGB1刺激12小時后，與脾T淋巴細胞以1:100的細胞比例混合培養(yǎng)，于共同作用后3天觀察T淋巴細胞增殖反應、功能性極化（Th1/Th2）、IL-2表達情況。3.HMGB1刺激后，分別采用流式細胞術和PCR技術檢測DCreg表面Toll樣受體（TLR）4的表達，進一步觀察封閉TLR4受體對HMGB1刺激后DCreg分泌IL-10和IL-1

4、2水平、以及對T淋巴細胞增殖反應、功能性極化、IL-2表達的影響。
　　結果：1.HMGB1對小鼠脾臟DCreg功能的影響：（1）HMGB1刺激后，DCreg分泌IL-10、IL-12水平于12~24小時分別明顯升高和下降（P<0.01），其中以作用12小時后達穩(wěn)態(tài)；10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml的HMGB1刺激均可誘導DCregIL-10、IL-12分泌水平分別明顯上升和下降（P<0.01），其中HMGB1

5、的濃度為100ng/ml時，DCreg分泌IL-10、IL-12趨于穩(wěn)定。（2）與正常對照組相比，100ng/ml的HMGB1刺激DCreg12小時后，表面共刺激分子CD40、CD80、CD86和MHC-II表達均明顯下調（P<0.01）。2.HMGB1誘導的DCreg對小鼠脾T淋巴細胞功能的影響：HMGB1誘導的DCreg與T淋巴細胞以1:100的比例相互作用3天，與對照組比較，T淋巴細胞對絲裂原刺激的增殖反應明顯減弱，上清液中干擾素

6、（IFN）-γ/IL-4比值顯著降低，IL-2水平明顯降低（P<0.01）。3.HMGB1介導小鼠脾臟DCreg作用的受體機制：（1）100ng/mlHMGB1刺激12小時后，DCreg表面TLR4表達顯著上調（P<0.01）；（2）拮抗TLR4后，HMGB1刺激的DCreg分泌IL-10、IL-12水平與對照組比較變化不明顯，T淋巴細胞增殖反應、功能性極化、IL-2水平亦未見顯著改變（P>0.05）。
　　結論：1.HMGB1能