嚴(yán)重?fù)p傷后高遷移率族蛋白B1的改變及其與多器官損害的關(guān)系.pdf

1、目的：高遷移率族蛋白B1(HMGB1)作為一種晚期炎癥介質(zhì)，介導(dǎo)了膿毒癥和其他系統(tǒng)性炎癥的致死性效應(yīng)。本試驗(yàn)擬應(yīng)用重度燙傷延遲復(fù)蘇動(dòng)物模型，明確HMGB1 在嚴(yán)重燙傷中的表達(dá)變化規(guī)律，進(jìn)而闡明HMGB1 對(duì)多器官損害的影響并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步探討。觀察丙酮酸乙酯（EP）與中藥血必凈治療對(duì)重度燙傷延遲復(fù)蘇動(dòng)物HMGB1 表達(dá)影響及臟器損害的保護(hù)作用。旨在為嚴(yán)重?fù)p傷后機(jī)體膿毒癥及多器官功能障礙綜合征的預(yù)防和治療提供新思路。 方法：采

2、用30％TBSAШ度燙傷后延遲6小時(shí)（h）復(fù)蘇大鼠模型。雄性Wistar大鼠114只，隨機(jī)分為：①正常對(duì)照組（n=6），麻醉后活殺；②假燙傷組（n=18），在假燙傷后6h 腹腔內(nèi)注入生理鹽水（40 ml/kg），8、24、72h活殺，無(wú)菌取血及組織標(biāo)本，各時(shí)間點(diǎn)均為6只動(dòng)物；③燙傷組（n=30），在燙傷后2、12、24、36、48、60h分別給予3ml/次林格氏液腹腔內(nèi)注射腹腔內(nèi)注射，在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)活殺；④EP液（3.23mg/ml）治療

3、組（n=30），于燙傷后2、12、24、36、48、60h分別給予3ml/次EP液腹腔內(nèi)注射治療，在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)活殺。⑤血必凈治療組（n=30），在燙傷后2、12、24、36、48、60h分別給予血必凈注射液（4ml/kg）靜脈注射治療，在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)活殺。無(wú)菌留取血及組織標(biāo)本。后3組分別在燙傷后6h腹腔內(nèi)注入生理鹽水（40ml/kg）抗休克治療，活殺點(diǎn)分別為8、24、72h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)10只動(dòng)物。另設(shè)實(shí)驗(yàn)組研究EP與中藥血必凈治療對(duì)燙傷大

4、鼠生存時(shí)間的影響，觀察不同時(shí)間點(diǎn)給藥后各組動(dòng)物7天的死亡率。采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)組織HMGB1與TNF-α的基因表達(dá)；蛋白免疫印記法（Western blot）及免疫組化法（Immunohistochemistry）檢測(cè)組織HMGB1 蛋白的含量；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）分析組織TNF-α蛋白含量；全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清ALT、AST、BUN和Cr含量；肺組織髓過(guò)氧化物酶（MPO）活性采用酶學(xué)分光光度法測(cè)定；小腸組織

5、二胺氧化酶（DAO）活性采用分光光度法測(cè)定；采用HE染色觀察組織病理學(xué)變化。 結(jié)果： 1．正常大鼠肝、肺、腎組織均可表達(dá)一定量HMGB1 mRNA，燙傷延遲復(fù)蘇后8h肝、肺、腎組織HMGB1 mRNA表達(dá)顯著增高，傷后24h各組織HMGB1 mRNA 表達(dá)達(dá)峰值，并可持續(xù)至傷后72h。肝組織與肺組織的HMGB1蛋白水平變化與HMGB1 mRNA表達(dá)情況基本一致；腎組織HMGB1蛋白僅在燙傷延遲復(fù)蘇后24h表達(dá)顯著增加

6、。EP治療可顯著降低8h、24h及72h肝、肺、腎組織的HMGB1 mRNA/蛋白表達(dá)。中藥血必凈治療亦可顯著降低24h及72h的肝、肺、腎組織的HMGB1 mRNA表達(dá)。血必凈治療可有效降低24h及72h的肝、肺組織的HMGB1蛋白的表達(dá)，亦明顯降低了24h腎組織的HMGB1蛋白的含量。 2．燙傷延遲復(fù)蘇后8h，組織TNF-α mRNA/蛋白表達(dá)迅速升高，24小時(shí)基本恢復(fù)至傷前范圍；肝、肺組織TNF-α mRNA/蛋白水平于

7、傷后72小時(shí)不同程度再度升高，肝、肺組織TNF-α mRNA/蛋白表達(dá)于8h和72h呈雙峰樣增高；腎組織TNF-α mRNA/蛋白水平于8h和24h 顯著升高。EP治療可不同程度地抑制燙傷延遲復(fù)蘇后肝、肺組織8h及72h的TNF-α mRNA/蛋白表達(dá)，亦明顯降低腎組織傷后8h和24h的TNF-α mRNA/蛋白上調(diào)。血必凈治療抑制了燙傷延遲復(fù)蘇后72h肝組織TNF-α mRNA表達(dá)，顯著降低肝組織傷后8h及72h的TNF-α蛋白含量。

8、同時(shí)，肺組織8h和72h的TNF-α mRNA表達(dá)顯著降低，72h肺組織的TNF-α蛋白表達(dá)亦明顯受到抑制；此外，對(duì)腎組織TNF-α mRNA/蛋白表達(dá)的下調(diào)作用僅在燙傷延遲復(fù)蘇后24h。 3．燙傷延遲復(fù)蘇大鼠血清ALT、AST和BUN、Cr水平均呈現(xiàn)不同程度地升高；其中血清ALT、AST和Cr在24h達(dá)峰值，血清AST值可持續(xù)升高至72h，血清Cr雖然升高較晚，但是可持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，72h仍顯著升高。肺組織MPO活性于燙傷延遲

9、復(fù)蘇后8h顯著升高，24h達(dá)高峰，72h下降至接近正常水平。腸組織DAO活性在燙傷延遲復(fù)蘇后8h~24h持續(xù)降低。EP治療可顯著降低燙傷延遲復(fù)蘇大鼠血清ALT、AST在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的水平，可明顯降低24h血清Cr及8h、24h血清BUN的含量。血必凈治療可有效降低延遲復(fù)蘇大鼠血清ALT、AST在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的水平（除傷后8h血清AST），能明顯降低24h、72h血清Cr含量及24h BUN的含量。EP治療能顯著降低燙傷延遲復(fù)蘇大鼠術(shù)后8h、

10、24h肺組織MPO活性；亦能明顯升高傷后8h~24h小腸DAO活性。此外，血必凈治療可以顯著降低燙傷延遲復(fù)蘇大鼠術(shù)后24h肺組織MPO活性，并升高傷后8h~24h小腸組織DAO活性。 4．燙傷延遲復(fù)蘇大鼠肝、肺、腎組織在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均表現(xiàn)炎細(xì)胞侵潤(rùn)，形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞明顯。EP與血必凈治療對(duì)于燙傷延遲復(fù)蘇大鼠的肝、肺、腎組織炎癥病變均有改善，其病理?yè)p傷程度明顯減輕。 5．EP和血必凈注射液治療均可顯著降低嚴(yán)重燙傷延遲復(fù)蘇大鼠的

11、死亡率。與燙傷組相比，EP治療組動(dòng)物的總死亡率顯著降低（P<0.01）。與燙傷組相比，血必凈治療組動(dòng)物的總死亡率亦顯著降低（P<0.05）。 結(jié)論： 1. 燙傷延遲復(fù)蘇可以促進(jìn)HMGB1基因表達(dá)與合成釋放，其動(dòng)力學(xué)變化規(guī)律表現(xiàn)為HMGB1產(chǎn)生較晚、下降緩慢的“晚期炎癥介質(zhì)”特點(diǎn)。HMGB1在誘導(dǎo)嚴(yán)重燙傷動(dòng)物過(guò)度的炎癥反應(yīng)與多器官功能損害中具有重要作用。 2. 組織TNF-α表達(dá)上調(diào)可能有介導(dǎo)產(chǎn)生HMGB1的效應(yīng)