hNrf1-TCF11對肝細胞癌生物學(xué)行為的影響及其相關(guān)機制研究.pdf

1、肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是全球范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡的常見原因?？绾四た寡趸D(zhuǎn)錄因子Nrf1(nuclear factor-erythroid2 p45 submit-related factor1)是Cnc-bZIP(cap‘n’collar basic-region leucinezipper)即Cnc堿性亮氨酸拉鏈亞家族成員之一，通過調(diào)控下游抗氧化酶、解毒酶、26s蛋白酶體亞基基因的轉(zhuǎn)錄，保

2、護細胞和組織免受氧化應(yīng)激的影響，引發(fā)細胞進行適應(yīng)性變化以維持機體內(nèi)平衡。研究證實在成年小鼠肝臟特異敲除Nrf1會誘發(fā)肝細胞癌[1,2]。
　　O連接的N-乙酰葡萄糖胺（O-linked N-acetylglucosamine，O-GlcNAc）單糖修飾是細胞為滿足不同生物學(xué)功能需要，進行的快速、可逆、動態(tài)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，由體內(nèi)的唯一的O-GlcNAc糖基轉(zhuǎn)移酶（O-GlcNAc Transferase, OGT）催化進行。O-

3、GlcNAc修飾的異常與腫瘤發(fā)生、遷移和侵襲過程密切相關(guān)，在肝細胞癌形成和發(fā)展中起著重要作用[3]。近期液相色譜-光譜法檢測提示，OGT可以與Nrf1蛋白相互作用，因此，探討糖蛋白Nrf1和O-GlcNAc修飾的關(guān)系，以及O-GlcNAc修飾對Nrf1生物學(xué)功能及Nrf1在肝細胞癌發(fā)生發(fā)展中作用的影響，將為Nrf1缺失誘發(fā)HCC發(fā)病機理、臨床病理聯(lián)系及預(yù)后判斷提供新的思路。
　　研究方法與結(jié)果：
　?、偾脺phNrf1/TCF

4、11對人肝癌細胞生物學(xué)行為的影響
　　我們首先用Western Blot檢測hNrf1/TCF11在人正常肝細胞HL-7702及不同肝癌細胞系中的表達，發(fā)現(xiàn)hNrf1/TCF11在人正常肝細胞HL-7702中高表達，而在不同肝癌細胞系中hNrf1/TCF11的表達較低。接下來構(gòu)建hNrf1/TCF11-shRNA慢病毒載體，篩選出沉默 hNrf1/TCF11最有效的shRNA靶序列為：ACAACCTGAGG AATACCTT。利用

5、構(gòu)建好的hNrf1/TCF11-shRNA慢病毒載體及Negative control shRNA空載質(zhì)粒病毒載體轉(zhuǎn)染人肝癌細胞系HepG2、MHCC97H、MHCC97L，建立穩(wěn)定敲減hNrf1/TCF11細胞系，分別命名為shNrf1實驗組和shNC陰性對照組。
　　MTT、細胞克隆形成實驗觀測細胞增殖情況，結(jié)果均顯示在HepG2細胞中敲減hNrf1可促進細胞增殖，而在另外兩株肝癌細胞shNrf1-MHCC97H、shNrf1

6、-MHCC97L與對照株shNC間無明顯差異。流式細胞技術(shù)測定各組細胞的細胞周期及凋亡，結(jié)果提示，實驗組（shNrf1）細胞出現(xiàn)了G2/M期停滯，而僅在HepG2細胞敲減hNrf1后細胞早期凋亡率明顯增加（p<0.05），而在其他兩株肝癌細胞中未見明顯變化。
　　最后我們用細胞劃痕體外遷移實驗及Transwell侵襲實驗觀察細胞運動能力，結(jié)果顯示在HepG2、MHCC97H、MHCC97L中敲減hNrf1(shNrf1-)后遷移及

7、侵襲能力均較對照組(shNC-)明顯增強（p<0.05）。
　?、谇脺phNrf1/TCF11對肝癌細胞遷移、侵襲影響的機制研究
　　用Real-time PCR檢測shNrf1-HepG2中與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達，發(fā)現(xiàn)MMP-2、MMP-9表達顯著升高，CDH1表達顯著下調(diào)（p<0.05）。Western Blot檢測各株shNrf1實驗組和shNC陰性對照組細胞E-cadherin、Vimentin及MMP-9的表達量，

8、結(jié)果再次證實敲減hNrf1/TCF11使肝癌細胞發(fā)生了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）。
　　對shNrf1-HepG2細胞進行表達譜測序，結(jié)果進行信號通路聚類分析發(fā)現(xiàn)，有效敲減hNrf1后HepG2細胞β-Catenin通路被激活。TOP/FOP Flash實驗顯示，沉默hNrf1能顯著激活β-Catenin的轉(zhuǎn)錄活性（p<0.01），Western blot檢測發(fā)現(xiàn)敲減hNrf1時β-Catenin及其調(diào)控的下游靶基因Cyclin D1

9、、c-Myc、MMP-7蛋白表達均增加。
　　放線菌酮蛋白追蹤實驗發(fā)現(xiàn)，與shNC-HepG2組相比shNrf1-HepG2細胞內(nèi)-Catenin半壽期延長，蛋白穩(wěn)定性增加。Western blot檢測細胞漿和細胞核內(nèi)-Catenin的表達情況發(fā)現(xiàn)，敲減hNrf1時細胞漿和細胞核內(nèi)活化的β-Catenin累積，而且易位入核的活性β-Catenin增加，而胞核內(nèi)易被降解的磷酸化的β-Catenin明顯減少。coIP實驗發(fā)現(xiàn)過表達hN

10、rf1時，β-Catenin的泛素化降解增強。最后通過建立裸鼠人肝癌肺轉(zhuǎn)移瘤模型，在體內(nèi)進一步驗證hNrf1/TCF11對人肝癌細胞生物學(xué)行為的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)shNrf1組肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量、結(jié)節(jié)體積均明顯大于shNC組。免疫組化染色法檢測模型鼠中肝臟β-Catenin的表達，結(jié)果shNrf1實驗組hNrf1/TCF11表達減少而β-Catenin累積增加。肺部轉(zhuǎn)移瘤中shNrf1組β-Catenin及其下游基因Cyclin D1的蛋白

11、表達量較shNC組明顯增高。Real-time PCR、Western blot檢測兩組模型鼠肝臟hNrf1/TCF11、E-cadherin、β-Catenin及其下游基因Cyclin D1、c-Myc、MMP7表達，結(jié)果shNrf1實驗組hNrf1/TCF11表達減少，E-cadherin mRNA水平變化不明顯，但蛋白表達顯著下調(diào)，β-Catenin及其下游基因Cyclin D1、c-Myc、MMP7表達均不同程度增加。
　

12、　③O-GlcNAc修飾對Nrf1的影響
　　Western blot檢測HEK293T細胞在不同培養(yǎng)條件下細胞內(nèi)O-GlcNAc水平及hNrf1/TCF11的豐度。結(jié)果顯示，在低糖培養(yǎng)基（G5）中加入OGT特異抑制劑Alloxan（100 M），細胞內(nèi)O-GlcNAc水平顯著下降，hNrf1/TCF11豐度顯著增加；相反高糖培養(yǎng)基（G25）中加入OGA抑制劑PUGNAc（50 M），細胞內(nèi)O-GlcNAc水平提高，hNrf1/T

13、CF11豐度下降。
　　GST-Pull Down、coIP實驗證實OGT與Nrf1在體外、細胞內(nèi)均能相互作用，并且兩者在細胞內(nèi)的相互作用受GlcNH2影響。
　　合成siRNA并經(jīng)real-time PCR、Western blot驗證篩選出能有效干涉OGT表達的siOGT-1序列為：sense5’-GGAGCCUUGCAGUGUUAUA-3’，Anti-sense5’-UAUAACACUGCAAGGCUCC-3’，ARE

14、-熒光素酶報告基因檢測顯示，干涉OGT時Nrf1的轉(zhuǎn)錄活性增強。Western blot分析顯示siOGT-1敲減OGT時，內(nèi)源性的Nrf1及其下游靶基因Lipin1和GCLM的蛋白表達均有明顯增加。相反，過表達OGT蛋白時，細胞內(nèi)由OGT催化的總的O-GlcNAc修飾蛋白較對照組細胞表達增加而內(nèi)源性的Nrf1蛋白表達減少，Nrf1調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄活性減弱。
　　coIP實驗表明過表達OGT時能增加Nrf1的泛素化，同時在G2

15、5培養(yǎng)條件下過表達OGT，能增加底物Nrf1降解；相反在低糖培養(yǎng)基（G5）中過表達OGT，細胞內(nèi)的Nrf1的降解減少，此時Nrf1的表達量明顯高于高糖時。而當轉(zhuǎn)染Nrf1、OGT(ΔTPR1-6)時Nrf1的表達量明顯高于共轉(zhuǎn)染Nrf1、OGT組。放線菌酮追蹤實驗顯示在干涉OGT時，Nrf1蛋白穩(wěn)定性增強。最后我們用Nrf1不同截短體與OGT共轉(zhuǎn)染，Western blot分析顯示Nrf1進行O-GlcNAc修飾的區(qū)域位于PEST2序列

16、富含絲氨酸的區(qū)段。
　　結(jié)論：
　?、僭谌烁伟┘毎礖epG2、MHCC97H、MHCC97L成功建立穩(wěn)定敲減hNrf1/TCF11的shNrf1實驗組和shNC陰性對照組細胞株。
　?、趆Nrf1/TCF11基因?qū)θ烁渭毎┥飳W(xué)行為的調(diào)控主要表現(xiàn)在敲減hNrf1/TCF11時肝癌細胞遷移和侵襲能力增強。
　?、矍脺phNrf1/TCF11時β-Catenin通路激活。通過減少β-Catenin磷酸化依賴的泛素化