mir-216a對胃癌細(xì)胞SGC7901生物學(xué)行為的影響及其相關(guān)機(jī)制.pdf

1、目的:
　　 1.檢測miR-216a在胃癌細(xì)胞SGC7901中的表達(dá)水平,建立microRNA的檢測方法。
　　 2.構(gòu)建has-mir-216a真核表達(dá)載體,實(shí)現(xiàn)其在胃癌細(xì)胞SGC7901中有效表達(dá),為進(jìn)一步研究mir-216a的功能打下基礎(chǔ)。
　　 3.觀察mir-216導(dǎo)入對SGC7901細(xì)胞生物學(xué)行為的影響并探討其相關(guān)機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.RT-PCR及Real-time PC

2、R檢測mir-216a在胃癌細(xì)胞SGC7901中的表達(dá)水平。
　　 2.依據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫中pre-mir-216a序列,設(shè)計(jì)引物；PCR擴(kuò)增pre-mir-216a基因并將其克隆至PGH載體,產(chǎn)生PGH-pre-mir-216a重組質(zhì)粒,酶切及測序驗(yàn)證；將pre-mir-216a基因克隆至pGenesil-1載體,產(chǎn)生pgenesil-1-has-mir-216a重組質(zhì)粒,HindⅢ酶切,測序驗(yàn)證；脂質(zhì)體法將pGenes

3、il-1-has-mir-216a載體及隨機(jī)片段HK的真核表達(dá)載體pGenesil-1／HK轉(zhuǎn)染入SGC7901細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24小時熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率,轉(zhuǎn)染后48小時RT-PCR及Real-time PCR法檢測成熟mir-216a在SGC7901細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 3.采用MTT法和細(xì)胞周期測定分析mir-216a對SGC7901細(xì)胞增殖的影響；采用MTT法檢測轉(zhuǎn)染前后阿霉素(ADR)對SGC7901細(xì)胞IC50值的變

4、化:采用RT-PCR、Real-time PCR及Western blot法檢測轉(zhuǎn)染前后YB-1mRNA及蛋白的表達(dá)變化；采用Real-time PCR及FCM檢測轉(zhuǎn)染前后MDR1mRNA及細(xì)胞膜P-gp表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.miR-216a在SGC7901中表達(dá)水平較低,建立起microRNA的檢測方法。
　　 2.將pre-mir-216a基因克隆至PGH載體,重組質(zhì)粒酶切及測序驗(yàn)證顯示,pr

5、e-mir-216a基因序列與the miRNA Registry的序列一致；將pre-mir-216a基因克隆至pGenesil-1載體,酶切及測序鑒定顯示與理論完全一致,成功構(gòu)建has-mir-216a真核表達(dá)載體；脂質(zhì)體法將pgenesil-1-has-mir-216a載體轉(zhuǎn)染入SGC7901細(xì)胞,獲三組細(xì)胞,依次為SGC／mir-216a、SGC／HK及SGC7901組。熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率約60％；RT-PCR結(jié)果顯示陽性

6、轉(zhuǎn)染組成熟mir-216a表達(dá)量明顯高于隨機(jī)片段組及空白對照組,三組細(xì)胞以U6標(biāo)化后的mir-216a灰度值分別為0.761,0.238,0.156；real-time PCR法結(jié)果顯示陽性轉(zhuǎn)染組mir-216a表達(dá)水平較隨機(jī)片段組提高約32倍。
　　 3.生長曲線提示陽性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞生長較對照組快,細(xì)胞周期動力學(xué)分析示陽性轉(zhuǎn)染組G1期細(xì)胞顯著減少,G2期與S期細(xì)胞顯著增多,提示mir-216a的導(dǎo)入可能促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖；MTT

7、法結(jié)果顯示陽性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的阿霉素IC50明顯高于隨機(jī)片段組和空白對照組,提示mir-216a可能參與了胃癌細(xì)胞對化療藥物ADM敏感性的調(diào)節(jié)；Real-time PCR顯示陽性轉(zhuǎn)染組MDR1mRNA較對照組提高2.75±0.10倍,流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,陽性轉(zhuǎn)染組p-gp表達(dá)上調(diào),熒光強(qiáng)度較對照組明顯增加,說明mir-216a的導(dǎo)入可能調(diào)節(jié)MDR1的轉(zhuǎn)錄及翻譯；RT-PCR顯示陽性轉(zhuǎn)染組YB-1 mRNA灰度值明顯增加,Real-tim

8、ePCR顯示陽性轉(zhuǎn)染組YB-1 mRNA較對照組上調(diào)3.27±0.10倍,Western blot結(jié)果顯示陽性轉(zhuǎn)染組YB-1蛋白條帶豐度明顯增加,說明mir-216a的導(dǎo)入可能促進(jìn)YB-1的轉(zhuǎn)錄及翻譯。
　　 結(jié)論:1.mir-216a在SGC7901細(xì)胞中表達(dá)較低,成功建立microRNA的檢測方法。2.成功構(gòu)建has-mir-216a真核表達(dá)載體,并實(shí)現(xiàn)其在胃癌細(xì)胞SGC7901中有效表達(dá)。3.mir-216a導(dǎo)入SGC79

9、01細(xì)胞能通過促進(jìn)細(xì)胞周期由G1期向S期及G2期轉(zhuǎn)換而促進(jìn)細(xì)胞增殖,并能降低細(xì)胞對化療藥物ADM的敏感性；轉(zhuǎn)染mir-216a導(dǎo)入SGC7901細(xì)胞能上調(diào)SGC7901細(xì)胞內(nèi)MDR1、p-gp及YB-1 mRNA、蛋白的表達(dá)。綜上所述,mir-216a可能通過轉(zhuǎn)錄及翻譯水平上調(diào)YB-1的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)MDR1 mRNA及p-gp的表達(dá),從而降低胃癌細(xì)胞對化療藥物ADM的敏感性。靶向mir-216a有望成為逆轉(zhuǎn)胃癌多藥耐藥的一條新的策略。