Tau蛋白入核及抗凋亡機(jī)制的研究.pdf

1、阿爾茨海默癥（Alzheimer disease，AD）是一種神經(jīng)退行性疾病，在其病理研究中 tau蛋白的作用機(jī)制一直是研究的重點(diǎn)之一。同時(shí)，研究證明，tau蛋白的過(guò)表達(dá)可以抑制細(xì)胞凋亡，對(duì)細(xì)胞發(fā)揮一定的保護(hù)作用。tau蛋白作為一種微管相關(guān)蛋白，主要分布在細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核內(nèi)也有存在。目前tau蛋白抗凋亡的具體作用機(jī)制和tau蛋白的入核機(jī)制都未明確。
　　本研究在已有的基礎(chǔ)上對(duì)tau蛋白的入核及其抗凋亡作用及機(jī)制進(jìn)行了探討。為了初步探

2、討tau是否含有疑似入核序列，我們將表達(dá)人類全長(zhǎng)tau蛋白的eGFP-C1-tau441質(zhì)粒一分為二，構(gòu)建質(zhì)粒eGFP-C1-tau（1-220）和eGFP-C1-tau（221-441），通過(guò)序列分析比對(duì)，證明了構(gòu)建質(zhì)粒的序列正確。將三種質(zhì)粒eGFP-C1-tau441，eGFP-C1-tau（1-220），eGFP-C1-tau（221-441）分別轉(zhuǎn)染鼠成神經(jīng)瘤細(xì)胞株（N2a）48h后進(jìn)行蛋白電泳，用識(shí)別tau不同位點(diǎn)的抗體tau

3、1和tau5對(duì)各組蛋白表達(dá)物進(jìn)行鑒定，證明質(zhì)粒構(gòu)建和表達(dá)成功。將三種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染鼠成神經(jīng)瘤細(xì)胞株（N2a）48h熒光染色照相，結(jié)果顯示，與另外兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，tau（1-220）表達(dá)產(chǎn)物在胞漿和胞核內(nèi)表達(dá)均勻，而另外兩種表達(dá)產(chǎn)物主要位于胞漿內(nèi)，免疫印跡實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了熒光結(jié)果，因此我們判斷tau（1-220）更容易入核。為探討不同tau序列的過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，對(duì)轉(zhuǎn)染 eGFP-C1-tau441、eGFP-C1-tau（1-220

4、）和eGFP-C1-vector空載質(zhì)粒后的細(xì)胞用0.5μmol/L廣譜凋亡誘導(dǎo)劑 staurosporine（STP）進(jìn)行3h凋亡誘導(dǎo)后提全蛋白以及核蛋白進(jìn)行免疫印跡（Cleaved Caspase-3和Bcl-2蛋白作為凋亡標(biāo)記物），結(jié)果表明，與空載組比較，tau441和tau（1-220）組均具有顯著的抗凋亡作用[tau441，n=3，p<0.05；tau（1-220），n=3，p<0.01]，而且凋亡誘導(dǎo)后核蛋白內(nèi)tau蛋白的含

5、量尤其是tau（1-220）組明顯升高（n=3，p<0.01）。為進(jìn)一步研究tau蛋白抗凋亡時(shí)入核的tau441或者tau（1-220）片段與核內(nèi)DNA的關(guān)系，我們將轉(zhuǎn)染eGFP-C1-tau441，eGFP-C1-tau（1-220）質(zhì)粒的細(xì)胞在凋亡誘導(dǎo)前3h先加入20μmol/L紡錘菌素（抑制蛋白與DNA小溝結(jié)合）培養(yǎng)，然后進(jìn)行凋亡誘導(dǎo)（0.5μmol/L STP處理3h，該處理過(guò)程中不撤除紡錘菌素）后提取全蛋白和核蛋白進(jìn)行免疫印跡

6、后的結(jié)果表明，tau（1-220）轉(zhuǎn)染組加上紡錘菌素組與不加組相比Cleaved Caspase-3蛋白量明顯增加（n=3，p<0.05），表明tau蛋白的抗凋亡能力降低。同時(shí)，提取核蛋白進(jìn)行的免疫印跡也表明，加入紡錘菌素之后，凋亡誘導(dǎo)所導(dǎo)致的核內(nèi)tau蛋白量升高這一現(xiàn)象發(fā)生明顯改變，核內(nèi)蛋白量顯著減少（n=3，p<0.05）。綜合所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè)，tau蛋白的前半段tau（1-220）序列可能帶有引導(dǎo)tau蛋白入核的關(guān)鍵序列，t