鋁致tau蛋白異常磷酸化作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 (1)通過現(xiàn)況調(diào)查闡明鋁職業(yè)接觸人群的MCI患病情況，建立鋁職業(yè)接觸人群所引起的tau蛋白異常磷酸化位點(diǎn)與MCI之間的聯(lián)系；
　　 (2)通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討三氯化鋁對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及其與腦組織tau蛋白異常磷酸化表達(dá)的關(guān)聯(lián)性；
　　 (3)在人群研究，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，采用人源性神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株（SH-SY5Y)，利用鈣調(diào)蛋白激酶-Ⅱ（CaMK-Ⅱ）拮抗劑KN93和蛋白磷酸酶-

2、2A（PP-2A）激動(dòng)劑神經(jīng)鞘氨醇，以對抗tau蛋白的過度磷酸化研究鋁致tau蛋白異常磷酸化的機(jī)制。
　　 方法：
　　 (1)選取某電解鋁廠其電解車間66名退休工人作為接觸組，對照工人來自同一地區(qū)的某面粉廠退休工人70名，采用簡短精神狀態(tài)量表(MMSE)篩選MCI患者；同時(shí)采集所有研究對象空腹肘靜脈血，分離血清，采用電感耦合等離子質(zhì)譜法(ICP-MAS)測定血清鋁含量；分離淋巴細(xì)胞提取其蛋白，用western blot

3、測定淋巴細(xì)胞P-tau181、231、262、396磷酸化程度以及總tau(tau5)表達(dá)水平；分析兩組間血鋁濃度、MCI檢出率、P-tau181、231、262、396及tau5表達(dá)的變化情況，同時(shí)應(yīng)用多元統(tǒng)計(jì)學(xué)方法探討MMSE得分的影響因素，血鋁水平與MCI患病率的關(guān)聯(lián)性，MMSE得分、血鋁水平與P-tau181、231、262、396及tau5表達(dá)的相關(guān)性。
　　 (2)選取剛斷乳的昆明種小白鼠共320只，按體重隨機(jī)分為4

4、組，每組80只，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)。將AIC13混入飼料中喂養(yǎng)小鼠，分為高、中、低劑量組，劑量分別為120，12，1.2mg/kg.d，對照組正常飼養(yǎng)。染毒時(shí)間為2年，每半年進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)的測定，采用水迷宮實(shí)驗(yàn)、避暗實(shí)驗(yàn)、跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)檢測小鼠的認(rèn)知功能；神經(jīng)行為測定完畢后處死小鼠取腦組織，采用電感耦合等離子質(zhì)譜法(ICP-MAS)測定血清鋁水平和腦鋁含量；應(yīng)用HE染色和電鏡觀察小鼠腦組織的變化；提取腦組織蛋白用Western-blot檢測小鼠

5、腦組織P-tau181、231、262、396及tau5表達(dá)情況；分析不同劑量、不同時(shí)間小鼠學(xué)習(xí)記憶的變化，及其與血鋁、腦鋁、腦組織P-tau181、231、262、396及tau5表達(dá)的變化的關(guān)聯(lián)。
　　 (3)選取SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行染毒，實(shí)驗(yàn)分組分為空白對照、200μM AL3+、400μM AL3+、800μM AL3+、800μM AL3+＋0.5μMKN93、800μM AL3+＋5nM神經(jīng)鞘氨醇、800μM AL

6、3+＋DMSO、DMSO，染毒和干預(yù)48小時(shí)后測定各項(xiàng)指標(biāo)。采用CCK-8法測定細(xì)胞活力；采用Flu-3AM標(biāo)記，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度；用ELISA方法測定CaM含量、CaMK-Ⅱ含量、PP-2A含量；提取細(xì)胞蛋白用Western-blot檢測細(xì)胞蛋白P-tau181、231、262、396及tau5表達(dá)情況；分析CaMK-Ⅱ拮抗劑KN93和PP-2A激動(dòng)劑神經(jīng)鞘氨醇對抗Tau蛋白的異常磷酸化。
　　 結(jié)論：人群

7、研究結(jié)果提示長期鋁接觸可引起工人的認(rèn)知功能障礙，可能是MCI發(fā)病的危險(xiǎn)因素之一，高齡、男性和文化水平低、血鋁水平高可能是認(rèn)知功能障礙的高危因素；而淋巴細(xì)胞P-tau396、P-tau231、P-tau181的表達(dá)更適合監(jiān)測鋁作業(yè)人員認(rèn)知功能的下降。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究提示長期喂養(yǎng)三氯化鋁可引起小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的下降，其下降程度與染鋁劑量和染鋁時(shí)間有關(guān)；海馬組織是負(fù)責(zé)學(xué)習(xí)記憶功能解剖結(jié)構(gòu)，從病理結(jié)果顯示三氯化鋁可以引起海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的變化，細(xì)胞的

8、超微結(jié)構(gòu)顯示細(xì)胞內(nèi)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和突觸均受到損害；腦組織tau5、P-tau396、P-tau262、P-tau231的表達(dá)也隨著染鋁劑量劑量的增加表達(dá)增高，P-tau262、P-tau231蛋白表達(dá)變化除與劑量有關(guān)還與時(shí)間有關(guān)。提示長期染鋁導(dǎo)致小鼠學(xué)記憶功能的障礙與磷酸化tau蛋白的異常表達(dá)有關(guān)。體外干預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示三氯化鋁可引起SH-SY5Y細(xì)胞tau5、P-tau396、P-tau231、P-tau181表達(dá)的異常，其機(jī)制與由Ca