大鼠KA致癇后CDNFmRNA表達(dá)變化及rhGDNF抗癇、抗凋亡機(jī)制的研究.pdf

1、蘇州大學(xué)博士學(xué)位論文大鼠KA致癇后CDNFmRNA表達(dá)變化及rhGDNF抗癇、抗凋亡機(jī)制的研究姓名：程慶璋申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：外科學(xué)指導(dǎo)教師：包仕堯2001.6.1大鼠KA斂癇后GDNFmRNA表達(dá)變化及rhGDNF抗癇、抗凋亡機(jī)制的研究中英文摘要L=15mm，V=430800ram)。模型組(KA致癇組，n=12)于雙側(cè)腦室注入KA(03ug／側(cè))，建立大鼠癲癇模型；對(duì)照組(n=6)于雙側(cè)腦室注入等量生理鹽水。分別于術(shù)后4小時(shí)、6

2、小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)、18小時(shí)、24小時(shí)處死，快速取腦并行冠狀冰凍切片。用體外轉(zhuǎn)錄法制備35S標(biāo)記的GDNF反意cRNA探針在切片上行原位雜交。雜交切片部分置于D—maxX—ray膠片暗盒中曝光2周，部分切片在核乳膠NTB一，浸漬后4℃暗盒中曝光4周。膠片和切片分別顯影和定影，切片定影后甲酚紫染色，遞度酒精脫水，二甲苯透明，DPX封片。雜交結(jié)果通過(guò)顯、定影后宏觀自顯影的D—maxx線膠片圖象和微觀自顯影核乳膠浸漬切片進(jìn)行分析。前者對(duì)照

3、切片標(biāo)本確定雜交信號(hào)部位和雜交信號(hào)的強(qiáng)弱，后者通過(guò)顯微鏡觀察銀染顆粒的多少確定雜交信號(hào)細(xì)胞水平、強(qiáng)弱。3結(jié)果：對(duì)照組鼠未見癲癇發(fā)作，其海馬區(qū)未見GDNFmRNA表達(dá)；而模型組于注射KA10一15分鐘出現(xiàn)四級(jí)以上癲癇發(fā)作，持續(xù)3小時(shí)左右停止，癲癇鼠海馬神經(jīng)元在致癇后4小時(shí)以后出現(xiàn)GDNFmRNA表達(dá)強(qiáng)烈的上調(diào)反應(yīng)，12小時(shí)達(dá)高峰，且各區(qū)均有表達(dá)，此后逐漸衰減，24小時(shí)恢復(fù)正常。二、KA致癇后大鼠海馬邊緣系統(tǒng)神經(jīng)元凋亡分布及海馬Caspas

4、e一3酶活性變化1Ft的：探討KA致癇鼠邊緣系統(tǒng)敏感腦區(qū)細(xì)胞凋亡的機(jī)制；并檢測(cè)KA致癇后鼠海馬Caspase一3酶活性動(dòng)態(tài)變化2方法：1)雄性SD大鼠，體重220—3009，乙醚麻醉后于立體定位儀定位雙側(cè)腦室。分KA致癇模型組和生理鹽水注射對(duì)照組(方法同前述)。模型組于癲癇發(fā)作后存活分別為6小時(shí)、1天、3天、7天后處死(每時(shí)點(diǎn)n=5)，快速取腦冷凍，并行冠狀冰凍切片，取背側(cè)海馬、杏仁體、背側(cè)丘腦、下丘腦、梨狀皮層為觀察部位。切片用4％多

5、聚甲醛固定后用原位末端標(biāo)記法(TUNEL)對(duì)切片進(jìn)行凋亡細(xì)胞染色標(biāo)記，DAB顯色，HE復(fù)染后封片。對(duì)照組于相同時(shí)點(diǎn)處死(每時(shí)點(diǎn)n=2)，按同樣步驟進(jìn)行凋亡染色標(biāo)記。2)雄性SD大鼠按上述同樣方法分為KA致癇模型組與對(duì)照組，存活時(shí)間為6小時(shí)、1天、3天、7天、10天(每時(shí)點(diǎn)模型組n=5，對(duì)照組n=2)后快速處死取腦，4℃分離出雙側(cè)海馬，研磨凍融后制成細(xì)胞裂解物用FIENA(Fluorometricimmunosorbentenzymeas

6、say)法檢測(cè)Caspase一3酶活性，以熒光AFC相對(duì)強(qiáng)度(IJM)表示。3結(jié)果1)癲癇后凋亡細(xì)胞主要分布在邊緣系統(tǒng)的海馬CAI、CA3、門區(qū)、杏仁體、梨狀皮層、背側(cè)丘腦。凋亡細(xì)胞在癲癇24小時(shí)后即存在，37天為凋亡高峰期。而對(duì)照組無(wú)凋亡細(xì)胞檢出。2)KA致癇后6小時(shí)，鼠海馬即有Caspase一3活性顯著增高，一周內(nèi)保持高水平，10天開始下降；而正常鼠海馬幾乎無(wú)活性Caspase3檢出。三、外源性rhGDNF的抗癇機(jī)制與鈣結(jié)合蛋白(O