弓形蟲(chóng)疫苗候選抗原IMP1生物學(xué)特性及其免疫原性研究.pdf

1、弓形蟲(chóng)是一種專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生繁殖的機(jī)會(huì)性致病病原體，可以感染包括人在內(nèi)的幾乎所有的溫血?jiǎng)游?，?yán)重威脅人類(lèi)及動(dòng)物健康。正常人感染弓形蟲(chóng)后，大多數(shù)不表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，呈隱性感染狀態(tài)，但對(duì)嬰兒或機(jī)體免疫力低下或免疫抑制時(shí)（AIDS、骨髓移植、器官移植等）可表現(xiàn)出嚴(yán)重的臨床癥狀，甚至可以引起死亡。妊娠期母畜感染該病，?？梢鹆鳟a(chǎn)，死產(chǎn)，木乃伊胎以及其它一些嚴(yán)重的臨床癥狀，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失.目前，對(duì)于弓形蟲(chóng)病的防治仍以預(yù)防為主，無(wú)特效藥物。因

2、此，研發(fā)切實(shí)有效的疫苗是防治的關(guān)鍵。IMP1蛋白是2011年剛發(fā)現(xiàn)的蛋白，被認(rèn)為在弓形蟲(chóng)病疫苗開(kāi)發(fā)方面具有重要潛力.本研究通過(guò)分子生物學(xué)、基因工程學(xué)、免疫生物學(xué)等方法對(duì)弓形蟲(chóng)IMP1的表達(dá)特性及免疫原性進(jìn)行研究，探討IMP1及其相關(guān)蛋白的功能，為弓形蟲(chóng)病防控提供新的思路與方法.
　　 1.浙江省動(dòng)物弓形蟲(chóng)病血清流行病學(xué)調(diào)查
　　 為了解浙江省動(dòng)物弓形蟲(chóng)病的流行現(xiàn)狀，更好地為弓形蟲(chóng)病的防治提供科學(xué)的依據(jù)，本項(xiàng)目組成員采集了

3、來(lái)自浙江省十一地市的813份豬血清、70份奶牛血清、151份山羊血清、213份犬血清及60份貓血清樣品，進(jìn)行了弓形蟲(chóng)病的血清流行病學(xué)調(diào)查.結(jié)果表明，豬的感染率最高，平均血清陽(yáng)性率高達(dá)53.4％，其次為犬16.0％，貓13.3％及山羊2.7％.在對(duì)70份奶牛的血清進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，未有陽(yáng)性樣品檢出.對(duì)采樣背景較為詳細(xì)的豬、犬、貓樣品的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示，該病的血清陽(yáng)性率隨動(dòng)物的年齡增長(zhǎng)而顯著性升高.弓形蟲(chóng)血清陽(yáng)性率與飼養(yǎng)環(huán)境、動(dòng)物

4、品種等相關(guān).本試驗(yàn)首次對(duì)浙江省豬、奶牛、山羊、犬、貓弓形蟲(chóng)血清陽(yáng)性率進(jìn)行較為詳細(xì)的調(diào)查，調(diào)查結(jié)果顯示浙江省動(dòng)物特別是豬的弓形蟲(chóng)感染較為嚴(yán)重，鑒于目前尚無(wú)有效的疫苗用于該病的治療，因此制定合理的方案控制該病的傳播在浙江省動(dòng)物弓形蟲(chóng)的防控方面具有重要意義.
　　 2.基于SAG1基因弓形蟲(chóng)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立
　　 熒光定量PCR因其高效敏感的特性在各種病原的檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用，然而其檢測(cè)效果與所選擇的目的基因密切相

5、關(guān).本研究根據(jù)GenBank上公布的弓形蟲(chóng)RH株SAG1(又稱(chēng)P30)基因(X14080)保守區(qū)域序列設(shè)計(jì)特異性引物，采用SYBR(R)greenⅠ熒光染料法建立弓形蟲(chóng)的熒光定量PCR檢測(cè)體系.與傳統(tǒng)的PCR方法相比，該方法表現(xiàn)出更高的敏感性，最低可以檢測(cè)到一個(gè)弓形蟲(chóng)速殖子.對(duì)人工感染小鼠的不同組織進(jìn)行檢測(cè)，1天后各樣品即可被檢出（血液25％、脾臟50％、肺臟50％）.本方法特異性好，與新孢子蟲(chóng)、大腸桿菌、牛巴貝斯蟲(chóng)、布氏錐蟲(chóng)、隱孢子蟲(chóng)

6、、犬弓首蛔蟲(chóng)DNA均無(wú)交叉反應(yīng).用建立的方法對(duì)臨床181份豬血進(jìn)行檢測(cè)，有11份樣品檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，比普通PCR的9份表現(xiàn)出更高的敏感性.研究結(jié)果表明，基于SAG1基因建立了一種可靠的弓形蟲(chóng)SYBR(R) greenⅠ熒光定量PCR檢測(cè)方法，該方法的建立可為弓形蟲(chóng)病理學(xué)、免疫學(xué)及治療方面的研究提供重要的技術(shù)支持.
　　 3.弓形蟲(chóng)IMP1的表達(dá)特性研究
　　 弓形蟲(chóng)IMP1是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的蛋白，在雞球蟲(chóng)、犬新孢子蟲(chóng)中都有高

7、度保守的同源序列，本研究通過(guò)基因克隆技術(shù)用弓形蟲(chóng)RH株為模板成功獲得了弓形蟲(chóng)IMP1序列，將所擴(kuò)增基因與GenBank上公布的弓形蟲(chóng)ME49株(XM_002370108;2e-36)的序列進(jìn)行相似性分析比較，分別在114(A-G)與342(T-C)處各有一個(gè)突變，序列相似性為99.8％，但對(duì)編碼氨基酸無(wú)影響.對(duì)所獲得的序列進(jìn)行原核表達(dá)、純化，制備了兔源多克隆抗體.通過(guò)間接免疫熒光技術(shù)進(jìn)一步對(duì)速殖子不同時(shí)期該蛋白的表達(dá)特性進(jìn)行研究.研究結(jié)

8、果發(fā)現(xiàn)在游離、吸附于細(xì)胞表面、入侵中、入侵后及納蟲(chóng)空泡中的速殖子IMP1均有表達(dá)，均被定位于蟲(chóng)體表面，且在有些蟲(chóng)體的頂端表達(dá)更為強(qiáng)烈.該研究為進(jìn)一步闡明IMP1的功能奠定了基礎(chǔ).
　　 4.弓形蟲(chóng)二價(jià)重組亞單位疫苗rSAG1-IMP1的免疫原性研究
　　 利用分子生物學(xué)技術(shù)分別構(gòu)建BL21-pET30a-IMP1及BL21-pET30a-SAG1-IMP1原核表達(dá)系統(tǒng)，IPTG誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá).用純化后的重組蛋白免疫I

9、CR小鼠，探討弓形蟲(chóng)重組蛋白rSAG1-IMP1的免疫效果.按照每只小鼠100μg融合蛋白的劑量進(jìn)行首免，2周后按照每只小鼠50μg融合蛋白的劑量進(jìn)行二免，二免后兩周再加強(qiáng)免疫一次.分別于免疫前和首免后每2周小鼠眼眶采血分離血清進(jìn)行抗體檢測(cè)，持續(xù)至三免后4周;三免后2周取脾臟，進(jìn)行淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)和細(xì)胞因子檢測(cè);三免后兩周用新鮮傳代的弓形蟲(chóng)按500個(gè)速殖子/只的劑量攻毒，評(píng)價(jià)其免疫保護(hù)效果。結(jié)果表明各重組蛋白均能顯著提高機(jī)體對(duì)融合蛋白的

10、免疫應(yīng)答水平和淋巴細(xì)胞的增殖水平(P＜0.05):蛋白免疫組首免后4周抗體水平開(kāi)始顯著上升，首免后6周即可達(dá)到較高水平.其中二價(jià)亞單位疫苗rSAG1-IMP1的抗體水平要顯著高于單價(jià)亞單位疫苗rIMP1和SAG1(P＜0.05).免疫后機(jī)體IgG1、IgG2a、IL-4、INF-γ水平均有所上升，但I(xiàn)gG1、IL-4更為明顯.攻蟲(chóng)試驗(yàn)表明各蛋白免疫組均能顯著延長(zhǎng)小鼠的存活時(shí)間，弓形蟲(chóng)重組二價(jià)亞單位疫苗rSAG1-IMP1較單價(jià)亞單位疫苗

11、具有更好的免疫效果.
　　 5.減毒沙門(mén)氏菌為載體傳遞弓形蟲(chóng)IMP1基因的免疫原性研究
　　 研究利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建了攜帶有弓形蟲(chóng)IMP1基因的減毒沙門(mén)氏菌活載體核酸疫苗ZJ111/pcDNA3.1-IMP1、ZJ111/pcDNA3.1-SAG1-IMP1.將構(gòu)建的活載體核酸疫苗與空載減毒沙門(mén)氏菌ZJ111/pcDNA3.1免疫ICR小鼠，分別通過(guò)抗體水平檢測(cè)、抗體亞類(lèi)檢測(cè)、淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)、細(xì)胞因子檢測(cè)以及攻蟲(chóng)試

12、驗(yàn)等，探討減毒沙門(mén)氏菌活載體核酸疫苗ZJ111/pcDNA3.1-IMP1、ZJ111/pcDNA3.1-SAG1-IMP1的免疫效果.結(jié)果表明:減毒沙門(mén)氏菌活載體核酸疫苗ZJ111/pcDNA3.1-IMP1、ZJ111/pcDNA3.1-SAG1-IMP1具有良好的免疫原性，可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的體液及細(xì)胞免疫應(yīng)答，顯著提高機(jī)體INF-γ的分泌及IgG2a水平(P＜0.05)，對(duì)小鼠抵抗弓形蟲(chóng)感染具有一定的免疫保護(hù)效果，可顯著延長(zhǎng)小

13、鼠的存活時(shí)間(P＜0.05).而且二價(jià)核酸疫苗ZJ111/pcDNA3.1-SAG1-IMP1的免疫保護(hù)效果要顯著的好于單價(jià)核酸疫苗ZJ111/pcDNA3.1-IMP1.
　　 綜上，本研究基于SAG1基因建立了一種可靠的弓形蟲(chóng)SYBR(R) greenⅠ熒光定量PCR檢測(cè)方法，首次對(duì)浙江省豬、奶牛、山羊、犬、貓弓形蟲(chóng)血清陽(yáng)性率進(jìn)行較為詳細(xì)的調(diào)查，通過(guò)制備IMP1多克隆抗體，應(yīng)用間接免疫熒光技術(shù)對(duì)弓形蟲(chóng)速殖子感染不同階段的IM