人TGF-β1自體疫苗的構(gòu)建及其免疫原性的鑒定.pdf

1、本文從自體疫苗的研究出發(fā)，設(shè)想利用轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforminggrowthfactorβ1，TGF-β1)的免疫原性來誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗TGF-β1的中和抗體，抑制TGF-β1的生物活性，消弱它對晚期腫瘤患者的免疫抑制效應(yīng)，從而達(dá)到輔助腫瘤免疫治療的目的。 研究方法與結(jié)果：成功構(gòu)建了包含pGEX-4T-1-TGF-β1基因的工程菌DH5α，用0.5mMIPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，Western-blot分析表明目的蛋白可

2、以和TGF-β1單克隆抗體特異性反應(yīng)。裂菌后電泳結(jié)果顯示，該目的蛋白以包涵體的形式表達(dá)。對包涵體進(jìn)行洗滌、溶解及梯度透析去除變性劑，經(jīng)GST親和層析純化，獲得到了純化的目的蛋白，純度達(dá)到90％以上。并按經(jīng)典免疫程序免疫了BALB/c小鼠，最后一次免疫后10天取抗血清ELISA檢測結(jié)果顯示抗體滴度小于1:1000。可能是由于TGF-β1人鼠同源性高達(dá)99％的原因，導(dǎo)致了全長TGF-β1分子的低免疫原性。所以，又根據(jù)計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行TGF-β

3、1抗原表位預(yù)測，結(jié)果顯示共有112個氨基酸的人成熟型TGF-β1分子內(nèi)包含5個抗原表位，分別位于第4-10、13-23、40-67、73-95及103-109位氨基酸之間。因此，又構(gòu)建了人成熟型TGF-β1及包含2個抗原表位的人TGF-β1氨基末端32個氨基酸(縮寫為β32)和包含3個抗原表位的人TGF-β1羧基末端80個氨基酸(縮寫為β80)的GST和(或)His融合蛋白，為增強(qiáng)免疫原性又引入了T細(xì)胞輔助表位(TT830-843)。構(gòu)

4、建的重組表達(dá)載體pGEX-TT-β32、pGEX-TT-β80、pGEX-TT-hTGF-β1和pQE30-TGF-β1、pQE30-TT-β80在大腸桿菌中成功表達(dá)并進(jìn)行了親和純化，獲得了5種融合蛋白(GST-TT-β32、GST-TT-β80、GST-TT-β1和6×His-TGF-β1、6×His-TT-β80)。用純化的5種融合蛋白免疫BALB/c小鼠及新西蘭白兔結(jié)果顯示有較好免疫原性，抗體滴度均達(dá)到1:104，其中GST-TT

5、-β80免疫組超過1:104。另外，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)的方法檢測出幾種腫瘤細(xì)胞株均可以與TGF-β1單抗及幾種抗血清結(jié)合，其中與GST-TT-TGF-β1免疫組抗血清的結(jié)合能力最強(qiáng)。并且免疫細(xì)胞化學(xué)顯示其胞膜和核膜均被染色。 研究結(jié)論：構(gòu)建了人TGF-β1及其不同表位片段的不同融合蛋白疫苗并進(jìn)行了純化，利用融合蛋白疫苗免疫動物并進(jìn)行了抗血清鑒定，選擇出了其中兩種(GST-TT-β80和GST-TT-TGF-β1)免疫原性較