豬瘟病毒C株重組標(biāo)記疫苗候選株免疫原性與鑒別檢測.pdf

1、豬瘟(Classical swine fever, CSF)是由豬瘟病毒(CSFV)引起的一類能在家豬和野豬中流行，具有高度傳染性的傳染病，嚴(yán)重威脅養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展。CSFV是一種含有囊膜的單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒科瘟病毒屬成員，基因組長約12.3kb。病毒蛋白中，結(jié)構(gòu)蛋白E2、Ems以及非結(jié)構(gòu)蛋白NS3為主要免疫原性蛋白，其中E2誘導(dǎo)中和抗體，與病毒入侵和致病性緊密相關(guān)。我國對于豬瘟防控的主要策略為豬瘟兔化弱毒苗群體免疫，但無法通過血

2、清學(xué)方法區(qū)分疫苗免疫和自然感染動物。研究表明，CSFV流行毒株也已經(jīng)從之前的group1轉(zhuǎn)向group2，新基因亞型毒株不斷出現(xiàn)。CSF呈現(xiàn)地方性流行，癥狀非典型化，甚至在免疫豬群中也有發(fā)病。因此，開發(fā)新型豬瘟分子標(biāo)記弱毒疫苗仍然是當(dāng)今研究熱點(diǎn)。本課題主要研究目標(biāo):(1)利用特異性單克隆抗體探明豬瘟病毒1型和2型E2抗原區(qū)的差異;(2)構(gòu)建基于疫苗C株、攜帶流行毒株E2基因的嵌合重組病毒，評估其安全性和免疫原性;(3)探索豬瘟病毒Ems

3、核心抗原區(qū)氨基酸變異對病毒復(fù)制和病毒粒子形成的影響;(4)構(gòu)建以C株為骨架、攜帶牛病毒性腹瀉病毒Ems基因的嵌合重組病毒，評估其安全性和免疫原性。
　　1.針對豬瘟病毒E2蛋白單克隆抗體的制備與表位鑒定
　　為探究豬瘟病毒疫苗株C-strain與強(qiáng)毒株和流行毒株囊膜糖蛋白E2抗原差異性，我們利用原核表達(dá)的SM株和HZ1-08株E2-AD抗原區(qū)蛋白免疫BALB/c小鼠，應(yīng)用雜交瘤技術(shù)結(jié)合ELISA和IFA篩選，獲得了兩株穩(wěn)定分

4、泌抗E2的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株2B10和4F4。免疫印跡、IFA和ELISA鑒定表明，2B10僅能與SM株反應(yīng)，不能與C株和2型毒株反應(yīng);4F4能與2型流行毒株反應(yīng)，與C株無反應(yīng)性。已知第737位Cys突變的重組E2會破壞B/C區(qū)構(gòu)象，從而影響相應(yīng)單抗對該區(qū)域的識別。我們通過真核表達(dá)攜帶該位點(diǎn)突變的E2以鑒定不同單抗的識別區(qū)域，發(fā)現(xiàn)2B10識別線性表位，不受二級結(jié)構(gòu)的影響;4F4識別構(gòu)象表位，位于E2抗原區(qū)域B/C中。差異氨基酸反應(yīng)

5、性鑒定證實了2B10識別的線性表位僅存在于SM株E2，丙氨酸定點(diǎn)突變分析進(jìn)一步證實其識別表位為707IXPXGXGG714。4F4識別構(gòu)象表位位于流行毒株E2的N端高變區(qū)1(HAR1)，Glu713為關(guān)鍵氨基酸。二株單抗均具備潛在鑒別診斷價值。
　　2.攜帶流行毒株E2的嵌合重組豬瘟病毒疫苗C株的鑒定與免疫原性
　　鑒于CSFV流行毒株的E2蛋白的抗原多樣性，特別是它們與疫苗毒株之間的較大差異，可能影響疫苗的免疫保護(hù)效力。因

6、此，在本實驗室之前建立的CSFV-C株反向遺傳學(xué)操作系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了基于C株、攜帶流行毒株HZ1-08的E2主要抗原區(qū)域(870bp)和N端抗原高變區(qū)1(HAR1，90bp)的感染性克隆，拯救獲得了2株嵌合重組病毒RecC-HZ-E2和RecC-HAR1; HAR1缺失的感染性克隆無法拯救獲得子代病毒。兩株嵌合重組病毒與親本病毒RecC在體外生長沒有差異，能在兔體內(nèi)復(fù)制，并誘導(dǎo)產(chǎn)生定型熱反應(yīng)和特異性抗體。嵌合重組病毒免疫豬后沒有出現(xiàn)

7、體溫變化和臨床癥狀;免疫后第14天RecC-HZ-E2免疫豬能夠檢測到低水平的病毒血癥。免疫后第7-10天血清中能夠檢測到特異性E2和Erns抗體，嵌合重組病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫血清與流行毒株E2的反應(yīng)性和體外中和能力都明顯高于親本株RecC;免疫豬能夠抵御強(qiáng)毒SM株以及流行毒株QZ14攻擊，表明改造后的嵌合重組病毒可能比親本株更有效提供對流行毒株的保護(hù)力。
　　3.豬瘟病毒Erns核心抗原區(qū)氨基酸變異對病毒復(fù)制的影響
　　豬瘟

8、病毒Erns也能夠誘導(dǎo)動物產(chǎn)生特異性抗體，我們證實核心抗原區(qū)AR2蛋白(aa84-160)占優(yōu)勢，其中aa117-125為關(guān)鍵氨基酸，單一突變這些氨基酸在體外能影響抗體的結(jié)合。我們試圖在C株Erns上找到影響抗體結(jié)合而不影響病毒復(fù)制的關(guān)鍵氨基酸或抗原區(qū)，為開發(fā)“負(fù)篩選標(biāo)記”弱毒疫苗奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明，在C株全長感染性克隆上，核心抗原區(qū)AR2中aa117-125任一氨基酸單點(diǎn)或者連續(xù)缺失都無法拯救獲得子代病毒粒子;而在SM株全長感染性克隆

9、上，上述突變卻都能夠拯救獲得病毒粒子，最長甚至可以將117-125全部缺失。我們推測Erns該區(qū)域在SM和C株之間作用有所差異，為探尋這一差異，我們以C株結(jié)構(gòu)蛋白嵌合SM非結(jié)構(gòu)蛋白的重組病毒（C和G）和SM結(jié)構(gòu)蛋白嵌合C株非結(jié)構(gòu)蛋白的重組病毒（D和E）的全長感染性克隆為骨架進(jìn)行突變，能夠獲得117-118突變（缺失和Ala替換）的子代病毒，但其他位點(diǎn)氨基酸突變也無法拯救重組病毒。說明C株和SM株之間在Erns核心抗原區(qū)缺失對子代病毒產(chǎn)生

10、的影響有差異，結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白在其中均發(fā)揮作用。但由于以上重組病毒都無法在兔體內(nèi)復(fù)制，也未能誘導(dǎo)特異性抗體，無法進(jìn)行血清學(xué)分析。
　　4.攜帶牛病毒性腹瀉病毒Erns的嵌合重組豬瘟病毒C株的拯救及其生物學(xué)特性鑒定
　　為開發(fā)能夠區(qū)分野毒感染動物和疫苗免疫動物(Differentiationof infected and vaccinated animals，DIVA)的新型弱毒疫苗，我們構(gòu)建了以C株為骨架，攜帶牛病毒性腹

11、瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)基因型1b分離株Erns基因的嵌合重組病毒(RecC-B-Erns)作為候選疫苗株。RecC-B-Erns在體外培養(yǎng)細(xì)胞中生長特性與RecC一致;體內(nèi)試驗證明，它保持了親本毒株RecC在兔體內(nèi)復(fù)制并誘導(dǎo)產(chǎn)生定型熱反應(yīng)和特異性抗體的能力。豬免疫后第7-10天能夠檢測到與RecC相當(dāng)水平的針對E2的特異性抗體，而針對Erns抗體生成時間較E2遲1-3天。重組病毒Rec

12、C-B-Erns的兔和豬全血清與BVDV1b型Erns截短蛋白B-tErns-X反應(yīng)性良好，而與C株截短蛋白C-Erns-Y沒有反應(yīng)性;相反RecC誘導(dǎo)產(chǎn)生血清或流行毒株感染血清與C-tErns反應(yīng)性良好，而與B-tErns較差。受試豬未呈現(xiàn)任何臨床癥狀，但能有效誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，并能抵御強(qiáng)毒株和流行毒株的攻毒，證明其良好的安全性和保護(hù)力，能夠作為豬瘟標(biāo)記弱毒疫苗的候選。此外，我們制備了分別針對C株Erns和BVDV1b型Erns的單克

13、隆抗體3E8和4D6，這兩個單抗識別的均為線性表位，并且3E8只與豬瘟病毒Erns核心抗原區(qū)有反應(yīng)，4D6只與BVDV1b型Erns蛋白反應(yīng)，二者識別抗原表位可用于下一步鑒別診斷試劑盒的開發(fā)。
　　綜上所述，本研究利用單克隆抗體探明了流行毒株與疫苗C株在E2部分區(qū)域抗原結(jié)構(gòu)的差異，探明了E2高變區(qū)HAR1與中和抗體的形成密切相關(guān);攜帶流行毒株E2或HAR1的嵌合重組病毒誘導(dǎo)針對2型的中和抗體能力高于親本株RecC，免疫豬能夠抵御強(qiáng)