間充質干細胞對小鼠心臟死亡供體移植肝的保護作用及機制研究.pdf

1、第一部分規(guī)范化小鼠心臟死亡供體肝移植模型的構建
　　[目的]肝臟移植是治療終末期肝病的唯一有效治療手段。而供肝短缺成為嚴重制約肝臟移植發(fā)展的難題。心臟死亡供體(DCD)器官捐獻成為增加供肝來源的重要策略。由于難以避免的冷熱缺血損傷，心臟死亡供體捐獻的肝臟面臨著短期移植物失功和遠期膽道并發(fā)癥等系列問題。如何減輕損傷，提高心臟死亡供肝的質量成為近年來研究的熱點和難點。小鼠在移植免疫、缺血再灌注損傷等方面具有不可比擬的優(yōu)勢，但目前尚無較

2、好的小鼠模型研究心臟死亡供體相關肝移植的損傷，因此需要構建一套統(tǒng)一規(guī)范的小鼠無心跳供體肝移植模型，為科研工作者進行相關研究提供動物平臺。
　　[方法]本實驗構建了一套規(guī)范化的小鼠心臟死亡供體肝移植模型，該模型采用動脈重建的方式，以熱缺血時間的長短為依據(jù)對心臟死亡供體肝移植后的存活時間和肝臟變化進行了研究，以確定最佳動物模型時間。
　　[結果]供體心臟停跳0min、5min、10min和20min后進行肝臟移植，移植術后7天的

3、受體存活率分別為100％，75％，37.5％和12.5％。隨著心臟停跳時間的延長，移植術后6h的血清ALT和AST水平顯著升高，肝臟組織病理切片顯示移植肝細胞從水腫到點狀壞死再到片狀壞死的變化過程;術后移植肝內IL1α、IL1β、TNFα、IFNγ、IL6、IL10及Kupffer細胞標志物F4/80呈現(xiàn)普遍下降趨勢。
　　[結論]隨著供體無心跳時間的延長，供肝的缺血/再灌注損傷加重，質量顯著下降，移植術后供肝內免疫細胞呈現(xiàn)低免疫

4、應答狀態(tài)，Kupffer細胞受損喪失，受體存活率顯著下降。經(jīng)過比較，供體心臟停跳10min為理想的建模條件，可以保證移植術后受體一定的存活率，同時便于觀察干預措施是否有效。
　　第二部分間充質干細胞對小鼠心臟死亡供體移植肝的保護作用研究
　　[目的]間充質干細胞(MSC)具有多向分化潛能，被證實擁有強大的免疫調節(jié)功能，能夠安全有效的應用于各種炎癥、缺血再灌注損傷、自身免疫性疾病模型中。近年來，MSC被逐漸應用到重癥肝炎、肝衰

5、竭乃至肝癌等肝臟疾病領域，成為研究熱點。在肝臟移植領域，MSC因其能夠抑制免疫排斥反應，減少免疫抑制劑用量得到了越來越多的重視和青睞，而MSC能否對心死亡供體捐獻的移植肝起到有效的保護作用還不甚清楚。本實驗利用構建的小鼠心臟死亡供體的肝移植模型，驗證MSC能否起到保護移植術后心臟死亡供肝的作用。
　　[方法]利用第一部分中構建的規(guī)范的小鼠心臟死亡供體肝移植模型，控制心臟停跳時間為10min，采用MSC過繼輸注的方法進行細胞治療，以

6、觀察術后受體存活時間和術后6h肝臟功能及病理指標，評價MSC對心臟死亡供肝的保護作用。
　　[結果]MSC的過繼輸注可以使心臟停跳10min供肝移植后的7天存活率從37.5％顯著提升至100％，同時有效減輕術后6h外周血中肝臟ALT、AST的表達和肝臟組織損傷，病理結果顯示MSC使移植肝的肝細胞出現(xiàn)極輕微的水腫，有別于對照組肝臟細胞大范圍水腫、點狀壞死。同時長期觀察發(fā)現(xiàn)，MSC治療組術后3月的存活率高達75％，肝功及病理切片顯示供

7、肝正常。
　　[結論] MSC的過繼輸注可以有效保護心臟死亡供體移植肝的質量，減輕肝臟損傷，從而有效提高受體術后存活率。長期觀察亦證實MSC的過繼輸注安全有效，并且不會存在誘發(fā)腫瘤的危險。
　　第三部分間充質干細胞保護小鼠心臟死亡供體移植肝的作用機制研究
　　[目的]心臟死亡供體捐獻的肝臟不可避免的存在熱缺血/冷缺血/再灌注的損傷，其中又以熱缺血對供肝的損傷最為明顯。在有效循環(huán)灌注喪失的情況下，肝臟進入乏氧狀態(tài)，肝內的

8、非實質細胞對乏氧非常敏感，其中Kupffer細胞對病理因素的應答對于肝臟的免疫狀態(tài)起到至關重要的作用。前述部分，分別證實了心臟停跳時間的延長顯著降低肝臟內Kupffer細胞的數(shù)量，同時MSC對無心跳供肝具有保護作用，但MSC和Kupffer細胞之間是否存在聯(lián)系尚未得知，且MSC具體通過哪種機制發(fā)揮保護作用尚無定論。本實驗利用上述動物模型，通過體內外實驗闡述MSC對供肝保護作用的機制。
　　[方法]利用氯化釓(GdCl3)清除供肝體

9、內的Kupffer細胞后進行無心跳肝移植，同時進行MSC過繼輸注，觀察術后受體存活情況，明確MSC和Kupffer細胞是否存在聯(lián)系。利用qRT-PCR法、Immunoassay法、免疫組化及體外細胞共培養(yǎng)等方法探究MSC發(fā)揮保護作用的具體機制。
　　[結果]過繼輸注MSC顯著提升了移植肝內Kupffer細胞表面F4/80的表達，同時GdCl3清除供肝Kupffer細胞后，MSC失去了對供肝的保護作用，受體術后生存率顯著下降。在保護

10、Kupffer細胞的同時，MSC的過繼輸注使促炎介質、趨炎因子等的表達均顯著下降。體外細胞共培養(yǎng)證實，MSC可以減少過氧化物引起的Kupffer細胞凋亡，PGE2抑制劑則逆轉這一保護作用，蛋白印記證實MSC可以抑制Kupffer細胞表達TLR4，進而激活ERK1/2，減少Fas/FasL的表達，減少caspase3的激活，從而抑制Kupffer細胞凋亡。
　　[結論] MSC主要通過PGE2減少缺血再灌注損傷中Kupffer細胞的