家蠶C-型凝集素11(BmCTL11)的表達特征及功能初探.pdf

1、昆蟲是地球生態(tài)系統(tǒng)中一類具有重要地位的生物，已經報道的大約有100多萬種。作為無脊椎動物，昆蟲缺少高等動物的適應性免疫，然而經過長期的自然進化，它們已然形成了一套高效快速的防御體系用于防御外界微生物或病原生物的侵染。在微生物表面存在保守度較高的病原相關分子模式(PAMPs)，無脊椎動物利用體內含有的模式識別受體(PRRS)能夠識別病原生物的PAMPs，從而辨別病原啟動進一步的免疫。
　　家蠶是重要的經濟昆蟲，同時也是重要的鱗翅目模

2、式昆蟲，與大多數無脊椎動物一樣，其體內有多種免疫識別分子/受體，其中一類稱為C-型凝集素。本論文利用家蠶為實驗材料，研究家蠶體內的一類C-型凝集素。通過本實驗室前期的研究工作，即家蠶微孢子蟲（Nosema bombycis）誘導家蠶全基因組轉錄應答分析顯示，家蠶C-型凝集素11基因（BmCTL11）在感染中后期持續(xù)高量表達，因此，本論文選擇BmC TL11基因，對其進行克隆表達和制備抗體，并對其轉錄特征及功能進行分析，主要研究結果如下:

3、
　　1.BmCTL11的生物信息學分析
　　對BmCTL11基因序列分析發(fā)現，該基因位于第10號染色體上;BmCTL11編碼一個含有307個氨基酸的多肽，蛋白預測分子量34.51KDa，等電點是4.69，包含兩個串聯(lián)的典型的C-型凝集素糖識別結構域(CRD)，分別是CRD1（47--148位氨基酸）和CRD2（184--303位氨基酸），編碼蛋白的開放閱讀框大小為924bp，無內含子。1--22位氨基酸為信號肽，含有兩個潛

4、在的N-糖基化位點，分別位于N214和N253氨基酸，對其二級結構的預測顯示BmCTL11含有4個α螺旋和18個β折疊，且其C端有甘露糖結合位點，暗示BmCTL11具有糖結合能力。分析正常家蠶的芯片數據，BmCTL11(BGIBMGA006623，sw21899)在脂肪體、表皮、卵巢、精巢、頭等組織中轉錄，卵巢中的轉錄水平高于精巢，其中脂肪體的轉錄水平最高，暗示該基因可能在免疫防御中發(fā)揮一定的作用。并且經N.bombycis誘導后，Bm

5、CTL11明顯上調表達。
　　2.BmCTL11基因表達譜分析
　　對家蠶不同組織進行RT-PCR分析，結果顯示:BmCTL11主要在脂肪體、馬氏管和生殖腺中轉錄，在絲腺和氣管中的轉錄水平較低，但在脂肪體中的轉錄水平較高;BmCTL11在家蠶的整個幼蟲時期幾乎都有轉錄，在蛹的后期沒有轉錄，這暗示BmCTL11在家蠶的幼蟲時期具有重要作用;此外，黑胸敗血芽孢桿菌(Bb)、粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)、

6、畢赤酵母（Gs115）、球孢白僵菌（Bba）、家蠶微孢子蟲(N.bombycis)、家蠶核型多角體病毒(BmNPV)6種微生物誘導BmCTL11的qRT-PCR分析結果表明該基因能夠被不同病原誘導上調表達，且在24h內BmCTL11的變化明顯，推測該基因在在病原侵染家蠶初期可能扮演著重要的角色。
　　3.Bm CTL11的克隆表達及其抗體制備
　　利用BmCTL11的序列，設計去除信號肽序列的克隆引物，擴增片段酶切后插入表達

7、載體pET32，構建pET32-BmCTL11融合表達載體，驗證正確后，導入Rosetta表達菌株，通過IPTG誘導表達，SDS-PAGE檢測結果顯示該重組蛋白以可溶蛋白和包涵體蛋白兩種形式表達。以純化后的rBmCTL11免疫昆明鼠制備rBmCTL11鼠源的多克隆抗體，ELISA方法測定抗體效價超過1∶102400。使用rBmCTL11多克隆抗體與家蠶的組織蛋白進行Western blotting分析，發(fā)現在60KDa位置附近有雜交信號

8、，與預測大小34.51KDa大小不一致，推測有如下可能:存在翻譯后修飾;自身形成二聚體;與家蠶體內的其它凝集素形成異二聚體或與家蠶體內其他蛋白形成復合體。
　　4.BmCTL11的功能初探
　　純化rBmCTL11獲取可溶蛋白后，進行rBmCTL11的結合試驗。糖結合實驗結果顯示rBmCTL11具有甘露糖、脂多糖(LPS)和半乳糖(Gal)的結合活性，并且rBmCTL11與LPS的結合具有鈣離子依賴性，說明rBmCTL11與

9、大腸桿菌的結合具有鈣離子依賴性;黑胸敗血芽孢桿菌、粘質沙雷氏菌、畢赤酵母和的結合實驗結果表明rBmCTL11能夠明顯結合這四種微生物，并且rBmCTL11能夠凝集黑胸敗血芽孢桿菌、粘質沙雷氏菌和畢赤酵母，推測rBmCTL11可能是通過識別病原表面的某些成分觸發(fā)家蠶的先天免疫反應。為進一步研究BmCTL11蛋白是否參與家蠶先天免疫，本文對家蠶血細胞的包被實驗和血漿的黑化實驗進行了研究，實驗結果顯示rBmCTL11能夠促進家蠶血細胞的包被與