魁蚶(Scapharca broughtonii)C型凝集素基因家族的克隆與表達.pdf

1、魁蚶（Scapharca broughtonii）俗稱赤貝、血貝、大毛蚶，從屬軟體動物門(Mollusca)，雙殼綱(Bivalvia)，翼形亞綱(Pterimorphia)，蚶目(Arcoida)，蚶科(Arcidae)，是大型海洋底棲貝類的一種，經(jīng)濟價值很高，作為我國水產(chǎn)養(yǎng)殖領域的重要養(yǎng)殖對象，具有良好的市場前景。由于過度捕撈、環(huán)境污染以及不健康養(yǎng)殖導致病害發(fā)生，使魁蚶資源嚴重衰退。目前對于魁蚶的研究，主要集中在基礎生物學以及養(yǎng)殖技

2、術的研究，分子免疫方面對于魁蚶的報道不多，因此研究魁蚶免疫相關的分子機制，對于完善和豐富魁蚶的免疫學資料具有重要的意義。
　　在454轉(zhuǎn)錄組測序的基礎上，本文利用 EST序列分析、cDNA末端快速擴增（RACE）技術從軟體動物門的魁蚶中克隆獲得四個凝集素基因 cDNA全長序列（命名為 Sb-Lec1、Sb-Lec2、Sb-Lec3、Sb-Lec4），并對這些基因進行了一定的功能分析，分析了四種基因在魁蚶中的組織分布以及在鰻弧菌（

3、Vibrio anguillarum）脅迫下的mRNA表達量的響應機制并成功表達了 Sb-Lec2蛋白，檢測其對大腸桿菌、鰻弧菌、金黃色葡萄球菌的凝菌活性。具體結(jié)果如下：
　　1.Sb-Lec1基因全長700bp，具有長度為504bp的開放閱讀框，其編碼167個氨基酸，其中信號肽序列的長度為23個氨基酸，129個氨基酸的糖識別結(jié)構(gòu)域（CRD）以及參與二硫鍵形成的6個半胱氨酸。預測蛋白分子量為19.11kDa，理論等電點為4.74。

4、多序列比對結(jié)果顯示，Sb-Lec1基因 CRD編碼的氨基酸序列與其他物種的凝集素基因具有相似的結(jié)構(gòu)，均含有形成二硫鍵的4個保守半胱氨酸。系統(tǒng)進化分析結(jié)果表明，魁蚶先與貝類等軟體動物聚為一支，然后與脊椎動物聚在一起。采用熒光定量PCR技術，檢測了Sb-Lec1在組織中的表達情況，結(jié)果顯示該基因能夠在肝胰腺、血淋巴、鰓、外套膜、閉殼肌、斧足組織中都表達，然而在肝臟中表達量最高。同時，分析了 Sb-Lec1基因在鰻弧菌（Vibrio angu

5、illarum）刺激下 mRNA表達量變化情況。結(jié)果表明，相對于對照組，菌刺激組Sb-Lec1基因在所檢測的每種組織中 mRNA表達量都顯著上調(diào)，隨著鰻弧菌暴露時間的延長，表達量一開始先升高，后來又出現(xiàn)降低的的趨勢。
　　2.Sb-Lec2基因全長756bp，具有489 bp的開放閱讀框，能夠編碼162個氨基酸，預測該蛋白分子量的大小為18.73 kDa，理論等電點為4.49，編碼一種分泌型蛋白，具有一個由135個氨基酸構(gòu)成的CR

6、D，該 CRD含有的參與二硫鍵形成的6個半胱氨酸。系統(tǒng)分析結(jié)果表明，魁蚶 Sb-Lec2在進化樹上的位置是先與雙殼貝類聚為一支，然后與魚類，哺乳類聚為一類，與其分類地位是相似的。運用熒光定量PCR檢測基因組織分布情況，結(jié)果顯示，Sb-Lec2分布于所有被測組織，在肝胰腺表達量最高。鰻弧菌刺激后，相對于對照組，Sb-Lec2基因在所檢測的每個組織中 mRNA水平上的表達量都顯著上調(diào)，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。將Sb-Lec2基因進行原核重組

7、蛋白表達，該重組蛋白表達形式是包涵體的形式，純化、透析復性后對鰻弧菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌都表現(xiàn)出抑菌活性，且對Ca2+無依賴性，對甘露糖無結(jié)合活性。
　　3.Sb-Lec3基因和Sb-Lec4全長分別為692bp、643bp，開放閱讀框長度分別為492bp和360bp，前者編碼了163個氨基酸，后者編碼了119個氨基酸，Sb-Lec3基因編碼的蛋白質(zhì)預測的蛋白分子量為18.96kDa，理論等電點為5.01，Sb-Lec4基因