灰葡萄孢BcADR1基因調(diào)控病菌生長發(fā)育和致病力的功能研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)室利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化(Agrobacterium tumefaciens-mediatedtransformation; ATMT)技術(shù)，構(gòu)建了灰葡萄孢的T-DNA插入突變體庫。通過篩選該ATMT突變體庫，獲得了一株不產(chǎn)生菌核的突變體BCt41，利用TAIL-PCR、PCR、Southern blotting、 RT-PCR等技術(shù)，確定了其突變基因?yàn)榫幋a一個(gè)功能未知的假定蛋白BcADR1。為進(jìn)一步明確BcADR1基因在灰葡萄孢生

2、長發(fā)育和致病過程中的功能及其調(diào)控機(jī)制，本研究利用RT-PCR和Real-time PCR技術(shù)，對(duì)BcADR1基因的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行分析;利用基因互補(bǔ)回復(fù)技術(shù)，構(gòu)建了BcADR1基因的互補(bǔ)回復(fù)突變體BCt41/BcADR1;通過對(duì)野生型BC22、突變體BCt41和回復(fù)突變體BCt41/BcADR1的表型和致病力分析，確定了BcADR1基因?qū)Σ【L發(fā)育和致病力的調(diào)控功能。通過對(duì)野生型BC22、T-DNA插入突變體BCt41和回復(fù)突變體BCt4

3、1/BcADR1的胞壁降解酶活性、毒素活性、產(chǎn)酸能力、穿透能力和附著胞形成、致病相關(guān)基因的表達(dá)、響應(yīng)逆境脅迫的能力等進(jìn)行分析，探討B(tài)cADR1基因調(diào)控病菌生長、發(fā)育及致病力的機(jī)制。為闡明灰葡萄孢的生長、發(fā)育和致病力的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　1.利用RT-PCR和Real-time PCR技術(shù)，檢測(cè)野生型BC22的菌絲、分生孢子和菌核中BcADR1基因的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BcADR1基因在病菌菌絲中的表達(dá)水平較高，而在分生孢子和菌

4、核中未檢測(cè)到該基因的表達(dá)。
　　2.構(gòu)建了BcADR1基因的互補(bǔ)回復(fù)載體pBARKS1-BcADR1-GFP，利用PEG介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)化T-DNA插入突變體BCt41的原生質(zhì)體，利用草胺膦篩選轉(zhuǎn)化子，通過PCR、Southern blotting和Real-Time PCR等技術(shù)對(duì)所獲得轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定。確定了所獲得的草胺膦抗性轉(zhuǎn)化子為BcADR1的互補(bǔ)回復(fù)突變體BCt41/BcADR1。
　　3.以灰葡萄孢野生型菌株(

5、BC22)為對(duì)照，對(duì)T-DNA插入突變體BCt41和回復(fù)突變體（BCt41/BcADR1）進(jìn)行表型和致病力分析，發(fā)現(xiàn)BCt41的生長速率較野生型和回復(fù)突變體明顯減慢，菌絲纖細(xì)、顏色淺，不產(chǎn)生菌核，產(chǎn)孢量明顯增強(qiáng)，細(xì)胞壁較厚、且胞外分泌物;且BCt41的致病力明顯減弱。表明BcADR1正調(diào)控灰葡萄孢的菌核產(chǎn)生、菌絲生長和致病力，負(fù)調(diào)控灰葡萄孢分生孢子的形成。
　　4.與野生型BC22和回復(fù)突變體(BCt41/BcADR1相比，T-D

6、NA插入突變體BCt41的果膠甲基反式消除酶(PMTE)、多聚半乳糖醛酸反式消除酶(PGTE)、纖維素酶(Cx)、果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)和乳糖醛酸酶(PG)的活性明顯降低。突變體BCt41的毒素活性較野生型和回復(fù)突變體明顯降低;產(chǎn)酸能力明顯減弱。表明BcADR1突變影響灰葡萄孢胞壁降解酶活性、毒素活性、產(chǎn)酸能力。
　　5.對(duì)野生型BC22、T-DNA插入突變體BCt41和回復(fù)突變體（BCt41/BcADR1）的穿透能力和附

7、著胞形成進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)3個(gè)菌株均能穿透玻璃紙，在PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)生菌落;而突變體BCt41產(chǎn)生的附著胞與野生型和回復(fù)突變體明顯不同。表明BcADR1突變影響灰葡萄孢附著胞的形成、但不影響其穿透能力。
　　6.利用Real-time PCR技術(shù)，檢測(cè)野生型BC22、T-DNA插入突變體BCt41和回復(fù)突變體BCt41/BcADR1中致病相關(guān)基因的表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)BCt41突變體中Bcg2、BcReg1、PkaR、Bac、Bcp1、Bm

8、p1、Bcg3、Sod1和Bos1基因表達(dá)水平較野生型和回復(fù)突變體明顯增強(qiáng)。表明灰葡萄孢BcADR1負(fù)調(diào)控這些致病相關(guān)基因的表達(dá)。
　　7.檢測(cè)野生型BC22、T-DNA插入突變體BCt41和回復(fù)突變體BCt41/BcADR1對(duì)NaCl、KCl、氟康挫和CFW的敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)T-DNA插入突變體BCt41在NaCl、KCl的培養(yǎng)基上生長速率較野生型和回復(fù)突變體明顯降低;BCt41突變體在氟康挫和CFW的培養(yǎng)基上明顯受到抑制。表明