細(xì)胞內(nèi)吞作用基因MoARKl和MoPANl在稻瘟病菌生長發(fā)育及致病過程中的功能研究.pdf

1、稻瘟病是水稻生產(chǎn)上一種毀滅性真菌病害，該病害嚴(yán)重限制和威脅全球的水稻生產(chǎn)。目前，人們廣泛地選育抗病品種防治此病，但由于該病原菌的致病性易變，新的致病小種的產(chǎn)生容易導(dǎo)致新選育的抗病品種失去利用價值。因此，稻瘟病的防治始終是水稻生產(chǎn)上的一個重要難題。控制該病害的重要前提是了解該病原真菌(Magnaporthe oryzae)生長發(fā)育及致病分子調(diào)控機(jī)制。隨著稻瘟病菌全基因組序列的公布及遺傳轉(zhuǎn)化操作系統(tǒng)的建立，其致病相關(guān)基因功能的發(fā)掘也隨之加快

2、，這就為尋找新的稻瘟病菌殺菌劑作用靶標(biāo)，設(shè)計新的稻瘟病控制策略提供理論依據(jù)。
　　 細(xì)胞內(nèi)吞(cell endocytosis)是普遍存在于酵母及哺乳動物中的一個復(fù)雜的質(zhì)膜運(yùn)輸過程，其包括各種蛋白質(zhì)及脂質(zhì)激酶，磷酸（酯）酶、信號分子的吸收和肌動蛋白骨架的排列。在此過程中，質(zhì)膜蛋白、脂質(zhì)及一些大分子物質(zhì)通過胞內(nèi)的囊泡運(yùn)輸被分配到早期的內(nèi)涵體中，隨之在成熟的內(nèi)涵體及液泡中降解，或者作為一種蛋白受體循環(huán)到質(zhì)膜中被重新利用。
　　

3、 在酵母細(xì)胞中，內(nèi)吞作用發(fā)生的早期，蛋白Ede1p和網(wǎng)格蛋白最早結(jié)合到細(xì)胞膜上參與細(xì)胞內(nèi)吞作用的初始。此外，Sla2p可以被循環(huán)利用，同時也可以與Sla1p相互作用，從而激活復(fù)合結(jié)構(gòu)Sla1p-Pan1p-End3p以進(jìn)行一系列蛋白的相互作用。因此，內(nèi)吞作用是一個連貫的過程，不僅存在各種物質(zhì)的循環(huán)利用，而且可逆的磷酸化也是必不可少的過程。在眾多的激酶家族中，Ark/Prk激酶家族是這一過程的重要調(diào)節(jié)激酶。雖然絲狀真菌中的細(xì)胞內(nèi)吞過程還

4、沒有較完整的闡釋，但是研究表明在絲狀菌絲的頂端確實(shí)存在內(nèi)吞作用。在稻瘟病菌中，已報道的ΔMoSec22和ΔMo Vam7的缺失突變體均不同程度影響了內(nèi)吞過程的發(fā)生。鑒于此研究基礎(chǔ)，為了進(jìn)一步了解該菌中細(xì)胞內(nèi)吞作用的發(fā)生過程，選取其中的Ark1及Pan1為研究對象。
　　 本文根據(jù)同源序列比對，在稻瘟病菌基因組數(shù)據(jù)庫中搜索到一個與酵母ARK1同源的基因，命名為MoARK1。序列分析表明該基因編碼的蛋白含有1020個氨基酸，在N端含

5、有一個磷酸激酶結(jié)構(gòu)域，在其C端存在三個磷酸化位點(diǎn)及一個富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域。根據(jù)同源重組原理，采用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法獲得了其敲除突變體ΔMoark1。生物學(xué)性狀分析發(fā)現(xiàn)，MoARK1缺失突變體對不同脅迫因子表現(xiàn)出低敏感性，產(chǎn)孢量降低，膨壓降低導(dǎo)致不能成功侵入寄主導(dǎo)致致病性降低;更重要的是MoARK1參與菌絲細(xì)胞壁完整性，頂體形成及細(xì)胞內(nèi)吞作用的調(diào)控。此外，MoArk1定位于菌絲頂端類似于actin蛋白，并且SNAREs蛋白家族中的MoSec2

6、2和MoVam7共同參與到MoARK1的亞細(xì)胞定位。
　　 本文同時在稻瘟病菌中發(fā)現(xiàn)另一個參與內(nèi)吞過程的酵母Pan1p的同源基因MoPAN1，該基因編碼的蛋白含有1462個氨基酸，在其N端含有兩個EH(Eps15Homology)功能域。MoPAN1的沉默導(dǎo)致突變體改變對不同脅迫因子的敏感性，影響其細(xì)胞壁完整性，產(chǎn)孢量降低，不能產(chǎn)生膨壓導(dǎo)致致病性喪失;更重要的是突變體喪失細(xì)胞內(nèi)吞作用。上述結(jié)果表明:MoPAN1作為一個調(diào)節(jié)中心參