2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、本實驗室前期從灰葡萄孢ATMT突變體庫中篩選獲得了一株致病力喪失的突變體BCt89,明確了其突變基因為BcPDR1;利用基因敲除技術(shù),初步確定了BcPDR1基因在灰葡萄孢生長發(fā)育和致病過程中的作用,本研究進一步利用互補回復(fù)技術(shù),在BcPDR1基因敲除突變體ΔBcPDR1的基礎(chǔ)上,創(chuàng)制了該基因的回復(fù)突變體ΔBcPDR1/BcPDR1;通過對野生型BC22、T-DNA插入突變體BCt89、敲除突變體ΔBcPDR1和回復(fù)突變體ΔBcPDR1/

2、BcPDR1的表型和致病力進行分析,明確BcPDR1基因在灰葡萄孢生長發(fā)育和致病過程中的功能;通過對突變體BCt89、ΔBcPDR1和ΔBcPDR1/BcPDR1的致病因素(胞壁降解酶、毒素、產(chǎn)酸能力)、信號途徑相關(guān)基因及致病相關(guān)基因的表達情況進行分析,確定BcPDR1基因調(diào)控病菌致病力的機制;通過檢測突變體BCt89、ΔBcPDR1和ΔBcPDR1/BcPDR1對非生物脅迫的敏感性,明確BcPDR1基因?qū)Σ【巧锩{迫的影響。研究結(jié)果

3、為闡明BcPDR1基因調(diào)控病菌生長發(fā)育和致病的分子機制奠定了基礎(chǔ),并為灰霉病的防治及新型殺真菌制劑的研制提供理論依據(jù)和實踐基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
  1.利用Real-time PCR技術(shù),對BcPDR1基因在灰葡萄孢野生型菌株BC22的不同生長時期、不同部位的表達水平進行檢測,確定了BcPDR1基因在病菌的菌絲、分生孢子和菌核中均有表達,在菌核和分生孢子中的表達水平較高,在菌絲中的表達水平相對較低。
  2.利用基因互補

4、回復(fù)技術(shù),成功構(gòu)建了BcPDR1基因的表達載體pBARKS1-BcPDR1-eGFP;利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù),將pBARKS1-BcPDR1-eGFP載體遺傳轉(zhuǎn)化進BcPDR1基因敲除的突變體ΔBcPDR1中;利用草銨磷抗性對轉(zhuǎn)化子進行篩選,并利用PCR、Southern blotting、RT-PCR、Real-time PCR等技術(shù)對所得轉(zhuǎn)化子進行鑒定,確定了試驗所獲得的轉(zhuǎn)化子為BcPDR1基因的回復(fù)突變體ΔBcPDR1/BcPDR1

5、。
  3.以灰葡萄孢野生型BC22作為對照,對BcPDR1基因的T-DNA插入突變體BCt89、敲除突變體ΔBcPDR1和回復(fù)突變體ΔBcPDR1/BcPDR1的表型進行分析,發(fā)現(xiàn)突變體BCt89和ΔBcPDR1的生長速率緩慢,菌落呈白色,且不產(chǎn)生菌核,菌絲顏色較淺、相對纖細、分隔短,不產(chǎn)生分生孢子;而野生型菌株和回復(fù)突變體的菌落呈灰白色,有菌核和分生孢子產(chǎn)生,菌絲顏色較深、分隔較長。表明BcPDR1基因正調(diào)控灰葡萄孢菌絲生長、

6、分生孢子和菌核的生成。
  4.對突變體BCt89、ΔBcPDR1和ΔBcPDR1/BcPDR1的致病力進行分析,發(fā)現(xiàn)野生型菌株和回復(fù)突變體均能在番茄果實和擬南芥葉片上產(chǎn)生明顯的病斑,而突變體BCt89和ΔBcPDR1在番茄果實和擬南芥葉片上均不能形成病斑,且在接種BCt89和ΔBcPDR1的擬南芥葉片中灰葡萄孢BcACTIN基因的表達水平顯著低于接種野生型和回復(fù)突變體的葉片,表明BcPDR1基因正調(diào)控灰葡萄孢的致病力。
 

7、 5.對突變體BCt89、ΔBcPDR1和ΔBcPDR1/BcPDR1的胞壁降解酶活性、毒素和產(chǎn)酸能力進行分析,發(fā)現(xiàn)突變體BCt89和ΔBcPDR1的乳糖醛酸酶(PMG)、乳糖醛酸酶(PG)和纖維素酶(Cx)酶活性較野生型菌株和回復(fù)突變體ΔBcPDR1/BcPDR1的明顯降低,而多聚半乳糖醛酸反式消除酶(PGTE)和果膠甲基反式消除酶(PMGE)的酶活性與野生型菌株和回復(fù)突變體沒有顯著性差別。突變體BCt89、ΔBcPDR1的毒素活性較

8、野生型和回復(fù)突變體明顯降低,產(chǎn)酸能力明顯減弱,表明BcPDR1基因正調(diào)控病菌的胞壁降解酶PMG、PG和Cx的活性、毒素活性和產(chǎn)酸能力。
  6.利用Real-time PCR技術(shù),對灰葡萄孢野生型BC22和突變體BCt89、ΔBcPDR1、ΔBcPDR1/BcPDR1中信號途徑相關(guān)基因和致病相關(guān)基因的表達水平進行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),突變體BCt89和ΔBcPDR1中信號途徑相關(guān)基因Bcp1、edka的表達水平明顯降低,pka、pka2

9、、bac、ras2基因的表達量明顯升高;突變體BCt89和ΔBcPDR1中致病相關(guān)基因lac1、P450-1、god1、cutA基因的表達水平明顯降低,btp1、bcbot1、glyox1、bcpg1和bcpg2基因的表達水平明顯高于野生型和回復(fù)突變體,表明BcPDR1基因參與調(diào)控灰葡萄孢信號途徑相關(guān)基因和致病相關(guān)基因的表達。
  7.對灰葡萄孢野生型BC22和突變體BCt89、ΔBcPDR1、ΔBcPDR1/BcPDR1響應(yīng)非生

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