青娥方對(duì)破骨細(xì)胞性骨吸收調(diào)控作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　本課題以骨吸收為切入點(diǎn)，通過(guò)在體和體外實(shí)驗(yàn)，研究青娥方對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松模鼠骨組織MMP-2、9、13、OPG、RANKL的影響及含藥血清對(duì)破骨細(xì)胞分化和骨吸收作用的影響。旨在從破骨細(xì)胞性骨吸收角度探討青娥方防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(PMOP)的作用機(jī)制，為青娥方在PMOP臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　方法:
　?。ㄒ唬┰隗w實(shí)驗(yàn)
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇、分組、造模、藥物干預(yù)及取材:選3月齡清潔級(jí)雌性SD大鼠14

2、0只，隨機(jī)分為造模組100只（腹部正中切口，切除雙側(cè)卵巢）、假手術(shù)組40只（除不摘除卵巢，其余同造模組）。術(shù)后12周，兩組各處死10只，用骨密度(BMD)、骨組織形態(tài)學(xué)指標(biāo)證明模型成立。造模組余鼠90只再隨機(jī)分成3組（每組30只）:青娥方組、雌激素組、生理鹽水組，統(tǒng)一于術(shù)后第13周開(kāi)始灌胃，分別灌服青娥方2.15g/kg/d、雌激素0.05mg/kg/d、生理鹽水2ml/只，假手術(shù)組余鼠30只亦灌服生理鹽水2ml/只，每天一次。于干預(yù)4

3、周、8周、12周三批次取材:腹主動(dòng)脈取血，離心取血清，-20℃凍存待測(cè);分離脛骨、股骨、腰椎等骨組織，-80℃保存待測(cè)。
　　2.指標(biāo)檢測(cè):DiscoveryWi雙能X線骨密度儀測(cè)定股骨BMD;脛骨上段常規(guī)切片及HE染色，應(yīng)用MoticMed6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，定量分析骨組織形態(tài);IG-A1000N萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)測(cè)定股骨最大載荷力(N)，ELISA法檢測(cè)血清中E2含量;生化法測(cè)定血清TRACP活力;第一、二腰椎分別檢測(cè)MM

4、P-2、9、13、OPG、RANKLmRNA和蛋白的含量。
　?。ǘw外實(shí)驗(yàn)
　　1.青娥方含藥血清制備:選3月齡清潔級(jí)雄性SD大鼠20只，隨機(jī)分為含藥血清組和空白血清組，每組10只，分別灌服青娥方2.15g/kg/d，生理鹽水2ml/只，灌胃7天，腹主動(dòng)脈取血制備青娥方含藥血清和生理鹽水血清。
　　2.指標(biāo)檢測(cè)
　　2.1.青娥方含藥血清對(duì)RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響:RANKL(30ng/mL)和M-

5、CSF(10ng/mL)誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞，同時(shí)分別加入10％生理鹽水血清和10％、15％、20％青娥方含藥血清，培養(yǎng)2d、4d、6d，動(dòng)態(tài)觀察活體細(xì)胞的變化;TRACP染色觀察破骨細(xì)胞數(shù)目;生化法測(cè)定細(xì)胞上清液中TRACP活力;Q-PCR法檢測(cè)貼壁細(xì)胞中PU.1、Mitf、NFATclmRNA的含量。
　　2.2.青娥方含藥血清對(duì)成熟破骨細(xì)胞骨吸收功能的影響:RANKL(30ng/mL)和M-CSF(10ng/mL)誘導(dǎo)R

6、AW264.7細(xì)胞，與骨磨片同時(shí)培養(yǎng)，7天后經(jīng)TRACP染色鑒定誘導(dǎo)成功后，分別加入10％生理鹽水血清和10％、15％、20％青娥方含藥血清，培養(yǎng)24h、48h、72h，動(dòng)態(tài)觀察活體細(xì)胞的變化;甲苯胺藍(lán)染色觀察骨磨片上骨吸收陷窩數(shù)目;生化法測(cè)定細(xì)胞上清液中TRACP活力;Q-PCR法檢測(cè)貼壁細(xì)胞中TRACP、RANK、MMP-9mRNA的含量。
　　結(jié)果:
　?。ㄒ唬┰隗w實(shí)驗(yàn)（在灌胃和取材過(guò)程中實(shí)驗(yàn)大鼠共死亡15只）

7、　　1.術(shù)后12周大鼠PMOP模型的鑒定:術(shù)后12周，模型組股骨BMD和血清E2含量明顯低于假手術(shù)組(P＜0.01);模型組骨小梁變細(xì)變稀，分布散亂，出現(xiàn)中斷，間距增大，呈現(xiàn)典型的骨質(zhì)疏松松質(zhì)骨的病理形態(tài)改變;兩組骨小梁面積百分比相比有顯著性差異（P＜0.01）。
　　2.骨密度測(cè)定:藥物干預(yù)后，兩藥物組股骨BMD呈上升態(tài)勢(shì)，高于同期生理鹽水組（P＜0.01或P＜0.05）。低于同期假手術(shù)組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。兩藥物

8、組相比，BMD指標(biāo)差異不大（P＞0.05）。
　　3.骨組織形態(tài)學(xué)分析:藥物干預(yù)后，假手術(shù)組骨小梁分布均勻，排列規(guī)則，小梁間隙正常。生理鹽水組變化明顯，骨小梁變細(xì)變稀，分布散亂，邊緣粗糙，完整性差，呈碎片、斷裂現(xiàn)象。與同期生理鹽水組比，兩用藥組骨小梁數(shù)目略多，結(jié)構(gòu)完整性明顯優(yōu)于生理鹽水組，骨小梁面積百分比亦明顯高于同期生理鹽水組（P＜0.01），但不及假手術(shù)組。兩藥物組相比，雌激素組略高于青娥方組，12周時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0

9、.05）。
　　4.骨生物力學(xué)結(jié)果:卵巢摘除后12周模型組股骨的最大載荷力明顯低于假手術(shù)組(P＜0.01)。藥物干預(yù)后，兩用藥組股骨最大載荷力均高于同期生理鹽水組(P＜0.01或P＜0.05)，但仍低于同期假手術(shù)組（P＜0.01或P＜0.05）。雌激素組股骨最大載荷力高于同期青娥方組，12周時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　5.血清E2測(cè)定:藥物干預(yù)后，兩用藥組血清E2濃度均明顯上升，高于同期生理鹽水組（P＜0.01

10、或P＜0.05），且與同期假手術(shù)組無(wú)明顯差異（P＞0.05）。從數(shù)值上看，青娥方組低于同期雌激素組，8、12周時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.05)。
　　6.血清TRACP活力測(cè)定:術(shù)后12周模型組血清TRACP活力明顯強(qiáng)于假手術(shù)組（P＜0.01）。藥物干預(yù)后，兩用藥組血清TRACP活力出現(xiàn)下降，青娥方組在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)與同期生理鹽水組相比都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　7.骨組織MMP-2、9、13和RANK

11、LmRNA和蛋白含量結(jié)果:切除卵巢12周后模型組骨組織的MMP-2、9、13和RANKLmRNA和蛋白表達(dá)量明顯高于假手術(shù)組（P＜0.01）。用藥后兩藥物組呈持續(xù)下降，三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均低于同期生理鹽水組（P＜0.01），除MMMP-13外，其余都明顯高于同期假手術(shù)組（P＜0.01）。
　　8.骨組織OPGmRNA和蛋白含量結(jié)果:卵巢摘除12周后，模型組骨組織OPGmRNA和蛋白含量高于假手術(shù)組（P＞0.05）。用藥后兩藥物組指標(biāo)含量明

12、顯高于同期生理鹽水組(P＜0.01)，但低于同期假手術(shù)組(P＜0.01)。
　?。ǘw外實(shí)驗(yàn)
　　與生理鹽水血清組相比，各用藥組破骨樣細(xì)胞數(shù)目，骨吸收陷窩數(shù)目，細(xì)胞上清液TRACP活力，細(xì)胞中PU.1、Mitf、NFATcl、TRACP、RANK、MMP-9mRNA表達(dá)量均隨用藥濃度的遞增逐漸減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.青娥方能明顯抑制破骨細(xì)胞性骨吸收作用。