AKT-mTOR-ULK1介導的自噬在骨保護素調控破骨細胞骨吸收活性中的作用機制.pdf

1、破骨細胞(osteoclast，OC)和成骨細胞(osteoblast，OB)組成了一對緊密協(xié)調的平衡機制，確保骨組織的健康。巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κB受體活化因子（RANKL）是促進破骨細胞分化和重吸收最主要的兩種細胞因子。而骨保護素(osteoprotegerin，OPG)，通過抑制破骨細胞的生成、活化和骨吸收能力增加骨密度。研究發(fā)現(xiàn)，破骨細胞的骨吸收過程與自噬密切相關，而自噬在OPG抑制破骨細胞骨吸收過程中的作

2、用機制尚未闡明。本研究以BALB/c小鼠骨髓源巨噬細胞(BMMs)分化形成的破骨細胞為研究對象，自噬抑制劑CQ、激動劑RAP和OPG處理后，從OPG對破骨細胞自噬的影響，自噬在OPG調控破骨細胞骨吸收過程中的作用，及AKT/mTOR/ULK1在OPG調控破骨細胞自噬過程中的作用，三方面闡明AKT/mTOR/ULK1介導的自噬在OPG調控破骨細胞骨吸收活性中的作用機制。為臨床應用OPG治療骨代謝疾病提供理論依據。
　　1.OPG對破

3、骨細胞自噬的影響
　　為了揭示OPG對破骨細胞自噬的影響，本研究通過添加不同濃度(0、20、40、80 ng/mL)的OPG處理細胞不同時間(0、3、6、12h)，結合CQ和RAP，研究破骨細胞自噬小體及自噬流的變化，免疫熒光檢測MDC和LC3熒光強度，透射電鏡檢測自噬小體數(shù)量。結果發(fā)現(xiàn)，40ng/mLOPG作用破骨細胞3h后，能夠顯著提高細胞的自噬水平。OPG可以減弱CQ對破骨細胞自噬的抑制作用，而RAP與OPG可以顯著增強破骨

4、細胞的自噬水平;OPG顯著增強了MDC和LC3熒光強度并提升了自噬小體數(shù)量，而CQ抑制了破骨細胞自噬溶酶體的降解，MDC和LC3熒光強度增強，自噬小體數(shù)量顯著減少，添加RAP促進了破骨細胞的自噬，且OPG可以增強RAP對自噬的促進效果。說明，40 ng/mL OPG對分化至3d的破骨細胞自噬流有顯著的促進作用，并促進了破骨細胞內自噬小體的形成。
　　2.自噬在OPG調控破骨細胞骨吸收中的作用
　　為了闡明自噬在OPG調控破骨

5、細胞骨吸收過程中的作用，本研究通過自噬抑制劑CQ、激動劑RAP處理破骨細胞，采用xCelligence系統(tǒng)實時監(jiān)測細胞指數(shù)變化，骨吸收陷窩試驗觀察破骨細胞骨吸收能力變化，熒光定量PCR和Western blotting檢測組織蛋白酶CathepsinK和抗酒石酸酸性磷酸酶TRAP的基因轉錄和蛋白表達水平。結果發(fā)現(xiàn)，添加OPG和RAP處理80h均能顯著抑制破骨細胞存活率，添加RAP組后期維持在較低水平;OPG和RAP處理組破骨細胞骨吸收能

6、力較對照組顯著下降，而CQ能夠部分減弱OPG對破骨細胞骨吸收能力的抑制作用;RAP使CathepsinK和TRAP基因轉錄及蛋白表達水平顯著升高，而CQ能夠部分抵消OPG對CathepsinK和TRAP蛋白表達的抑制作用。說明OPG在增強破骨細胞自噬的同時顯著降低了其骨重吸收能力。
　　3.AKT/mTORULK1信號通路在OPG調控破骨細胞自噬中的作用
　　為了探究AKT/mTOR/ULK1信號通路在OPG調控破骨細胞自噬

7、中的作用，本研究利用Western blotting檢測AKT、mTOR、ULK1等蛋白的磷酸化水平，免疫熒光檢測LC3和LAMP2共定位，透射電鏡檢測雙層膜結構的自噬小體。結果發(fā)現(xiàn)，OPG能夠劑量依賴性地降低P-AKT和P-mTOR蛋白表達，上調P-ULK1蛋白表達。OPG可以增強PI3K/AKT阻斷劑LY294002對P-AKT和P-mTOR的抑制作用，同時增強了RAP對P-AKT的抑制，促進了破骨細胞的自噬，結果提示OPG通過抑制

8、AKT/mTOR通路使破骨細胞的自噬水平增強;OPG可以顯著增強LC3和LAMP2熒光強度，并呈現(xiàn)顯著的共定位，添加自噬抑制劑3-MA可以顯著減弱熒光強度，mTOR抑制劑RAP可以顯著增強自噬水平，表現(xiàn)出熒光強度增加;OPG減弱了3-MA對破骨細胞自噬的抑制，較3-MA單獨處理組，OPG和3-MA共處理組中自噬溶酶體的數(shù)量顯著增多。說明40 ng/mL OPG可以通過AKT/mTOR/ULK1信號通路顯著增強分化至3d的破骨細胞自噬水平