流行性乙型腦炎病毒在宿主選擇壓力下基因變異規(guī)律的研究.pdf

1、流行性乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）屬于黃病毒科，是具有包膜的單股正鏈RNA病毒，基因組全長為10976個核苷酸，由5’與3’非編碼區(qū)及中間的單一開放讀碼框(open reading frame，ORF)組成，ORF首先編碼包含3432個氨基酸的多聚蛋白前體，經(jīng)酶切后形成3種結(jié)構(gòu)蛋白（C、PrM、E）和7種非結(jié)構(gòu)蛋白（NSl、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5）。

2、>　　病毒復(fù)制只能在宿主細胞內(nèi)進行。因此病毒基因變異必然會受到宿主選擇壓力的影響。JEV作為一種RNA病毒，由于RNA多聚酶缺乏校正功能，基因組核苷酸容易發(fā)生變異。在動物宿主與媒介昆蟲宿主交替?zhèn)鞑ミ^程中，或者在單一儲存宿主持續(xù)感染狀態(tài)下，JEV發(fā)生基因變異產(chǎn)生的變異毒株受宿主選擇壓力影響，其中生存適合度較高的毒株，在宿主體內(nèi)的感染增殖能力較強，容易獲得生長優(yōu)勢并成為優(yōu)勢毒株。
　　深入研究JEV在宿主選擇壓力下基因變異規(guī)律，能夠為

3、JEV分子流行病學(xué)調(diào)查提供理論依據(jù)，為流行性乙型腦炎疫情監(jiān)測預(yù)警和應(yīng)急防控提供技術(shù)支撐，為流行性乙型腦炎疫苗改進、免疫效果評估和特效藥物研發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐和靶標指引。
　　本研究選取京衛(wèi)研-1毒株（A2株，Beijing-1株或BJ-1株）和SA14毒株為實驗對象，以蚊蟲細胞（Aedes albopictus clone，C6/36）和地鼠腎細胞（Baby hamster kidney，BHK）交替?zhèn)鞔鳛榧毎惶鎮(zhèn)鞔鷮嶒災(zāi)Ｐ?，以?/p>

4、帶喙庫蚊與昆明鼠交替?zhèn)鞔鳛閯游锼拗髋c媒介蚊蟲交替?zhèn)鞔鷮嶒災(zāi)Ｐ?，模擬自然界中JEV在媒介蚊蟲和動物宿主間交替?zhèn)鞑ミ^程。并對交替?zhèn)鞔a(chǎn)生的部分毒株進行序列測定與分析比對，藉此研究 JEV在動物宿主與媒介蚊蟲交替?zhèn)鞔x擇壓力下基因變異規(guī)律。
　　同時，本研究將BJ-1毒株和SA14毒株分別在BHK細胞及C6/36細胞連續(xù)傳代，模擬自然界中JEV在單一儲存宿主體內(nèi)持續(xù)感染過程，建立單一細胞連續(xù)傳代實驗?zāi)Ｐ?。并對連續(xù)傳代產(chǎn)生的部分毒株進行

5、序列測定與分析比對，藉此研究JEV在單一宿主動物選擇壓力下基因變異規(guī)律。
　　此外，利用生物信息學(xué)技術(shù)，檢索GenBank中JEV序列及相關(guān)信息，與本研究測定的毒株序列分析比對，對本研究建立的動物宿主與媒介蚊蟲交替?zhèn)鞔鷮嶒災(zāi)Ｐ?、細胞交替?zhèn)鞔鷮嶒災(zāi)Ｐ秃蛦我患毎B續(xù)傳代實驗?zāi)Ｐ瓦M行對比分析和效果評估，探討JEV在自然界的分子流行病學(xué)特征和基因變異規(guī)律。
　　研究結(jié)果如下：
　　1. BJ-1傳代毒株、SA14傳代毒株接種C

6、6/36細胞及BHK細胞后均在3天左右出現(xiàn)典型細胞病變（Cell pathological effects，CPE）。腦內(nèi)接種JEV后3~5d，昆明乳鼠均出現(xiàn)散窩、抽搐、弓背等癥狀。BJ-1傳代毒株與SA14傳代毒株接種乳鼠后發(fā)病時間不存在顯著差異（P>0.05）。
　　2. BJ-1各組傳代毒株空斑滴度均值都顯著低于親本株空斑滴度；SA14各組傳代毒株則區(qū)別很大：經(jīng)BHK細胞連續(xù)傳代獲得的傳代毒株空斑滴度均值與親本株空斑滴度無顯

7、著差異；經(jīng)C6/36細胞連續(xù)傳代獲得的傳代毒株空斑滴度均值顯著低于親本株空斑滴度；經(jīng)C6/36和BHK細胞交替?zhèn)鞔约敖?jīng)三帶喙庫蚊和昆明鼠交替?zhèn)鞔@得的傳代毒株空斑滴度均值都顯著高于親本株空斑滴度。
　　3. BJ-1各組傳代毒株間空斑滴度均值不存在顯著差異；SA14各組傳代毒株間空斑滴度均值存在顯著差異，空斑滴度由高到低依次為：經(jīng)細胞交替?zhèn)鞔@得的傳代毒株、經(jīng)動物宿主與媒介蚊蟲交替?zhèn)鞔@得的傳代毒株、經(jīng)BHK細胞連續(xù)傳代獲得的傳

8、代毒株和經(jīng)C6/36細胞連續(xù)傳代獲得的傳代毒株。
　　4. BJ-1各組傳代毒株核苷酸變異位點數(shù)均超過100個；SA14親本株經(jīng)BHK細胞連續(xù)傳代獲得的傳代毒株和經(jīng)動物宿主與媒介蚊蟲交替?zhèn)鞔@得的傳代毒株，核苷酸變異位點數(shù)也都超過100個，而經(jīng)細胞交替?zhèn)鞔@得的傳代毒株和經(jīng)C6/36細胞連續(xù)傳代獲得的傳代毒株變異位點數(shù)均少于40個。BJ-1傳代毒株堿基變異類型均以T→C最多，而SA14傳代毒株堿基變異類型均以C→T最多。
　

9、　5. BJ-1傳代毒株和SA14傳代毒株核苷酸變異位點中發(fā)生回復(fù)突變的比例較高（分別為94.7％和91.8%），其中BJ-1親本株經(jīng)C6/36細胞連續(xù)傳代獲得的傳代毒株和經(jīng)動物宿主與媒介蚊蟲交替?zhèn)鞔@得的傳代毒株，以及SA14親本株經(jīng)BHK細胞連續(xù)傳代獲得的傳代毒株回復(fù)突變比例顯著高于其他各組傳代毒株。
　　6. BJ-1傳代毒株和SA14傳代毒株總的氨基酸變異位點數(shù)均為32個，發(fā)生回復(fù)突變的比例較高（分別為87.5%和59.4

10、%）；經(jīng)動物宿主與媒介蚊蟲交替?zhèn)鞔@得的傳代毒株變異位點數(shù)均多于其他實驗?zāi)Ｐ蛡鞔@得的傳代毒株；E蛋白變異位點數(shù)均多于其他蛋白。BJ-1傳代毒株和SA14傳代毒株氨基酸序列中與毒力、抗原性密切相關(guān)的氨基酸位點比較穩(wěn)定。
　　7. BJ-1親本株經(jīng)動物宿主與媒介蚊蟲交替?zhèn)鞔@得的傳代毒株發(fā)生回復(fù)突變的氨基酸位點數(shù)多于其他實驗?zāi)Ｐ蛡鞔@得的傳代毒株；SA14親本株經(jīng)BHK細胞連續(xù)傳代獲得的傳代毒株發(fā)生回復(fù)突變的氨基酸位點數(shù)多于其他實驗

11、模型傳代獲得的傳代毒株。
　　8. BJ-1親本株經(jīng)三種實驗?zāi)Ｐ蛡鞔@得的傳代毒株總的同義突變率為85.6%，dN/dS=0.17；SA14親本株經(jīng)三種實驗?zāi)Ｐ蛡鞔@得的傳代毒株總的同義突變率為77.3%，dN/dS=0.29；BJ-1毒株承受的純化選擇壓力高于SA14毒株。
　　9.11個 BJ-1傳代毒株（BP28、CP24、BCP8、BCP12、BCP16、BCP20、BCP24、BCP28、M10R10、M12R12

12、、M14R14）與BJ-1親本株相似性顯著減低，與SA14親本株相似性增強；7個SA14傳代毒株（BP12、M4R4、M6R6、M8R8、M10R10、M12R12、M14R14）與SA14親本株相似性顯著減低，與BJ-1親本株相似性增強。
　　研究結(jié)論如下：
　　1.建立 JEV細胞交替?zhèn)鞔鷮嶒災(zāi)Ｐ?，與動物宿主與媒介蚊蟲交替?zhèn)鞔鷮嶒災(zāi)Ｐ蛯Ρ?，發(fā)現(xiàn) BJ-1親本株經(jīng)上述兩種實驗?zāi)Ｐ蛡鞔@得的兩組傳代毒株間在核苷酸序列變異、氨

13、基酸序列變異以及生存適合度變化方面情況比較接近，但SA14親本株經(jīng)上述兩種實驗?zāi)Ｐ蛡鞔@得的兩組傳代毒株間存在顯著差別，提示不宜于采用細胞交替?zhèn)鞔鷮嶒災(zāi)Ｐ痛鎰游锼拗髋c媒介蚊蟲交替?zhèn)鞔Ｐ瓦M行JEV基因組分子進化研究。
　　2. BJ-1親本株、SA14親本株經(jīng)動物宿主與媒介蚊蟲交替?zhèn)鞔徒?jīng)細胞交替?zhèn)鞔@得的傳代毒株生存適合度均高于單一細胞連續(xù)傳代獲得的傳代毒株，提示蟲媒病毒進化“平衡假說”（trade-off hypothesi

14、s）不適用于JEV。考慮到JEV毒力顯著強于絕大多數(shù)其他蟲媒病毒，這一進化特征有利于 JEV在儲存宿主體內(nèi)持續(xù)感染。
　　3.經(jīng)三種實驗?zāi)Ｐ蛡鞔@得的 BJ-1傳代毒株、SA14傳代毒株在生存適合度方面存在較大差別。部分氨基酸位點變異與JEV生存適合度變化有關(guān)。例如， E蛋白E49K、NS5蛋白R29K突變與JEV生存適合度降低相關(guān)，NS1蛋白E127D突變與JEV生存適合度升高相關(guān)。
　　4.經(jīng)三種實驗?zāi)Ｐ蛡鞔@得的 BJ

15、-1傳代毒株、SA14傳代毒株核苷酸變異頻率較高，變異位點數(shù)較多，回復(fù)突變發(fā)生率較高。核苷酸變異均為單個堿基點突變，未發(fā)生插入與缺失，顛換多于轉(zhuǎn)換。JEV核苷酸序列中容易發(fā)生變異的核苷酸位點比較固定，同時堿基變異類型也比較固定。
　　5.經(jīng)三種實驗?zāi)Ｐ蛡鞔@得的 BJ-1傳代毒株、SA14傳代毒株氨基酸序列中與毒力、抗原性密切相關(guān)的氨基酸位點變異頻率較低。
　　6.經(jīng)三種實驗?zāi)Ｐ蛡鞔@得的BJ-1傳代毒株、SA14傳代毒株d