As2O3溫熱微環(huán)境誘導白血病細胞分化的機制研究.pdf

1、近年來，腫瘤在各種致死性疾病中躍居首位，嚴重影響著人類的健康。常規(guī)治療腫瘤的方法是放療和化療。放化療具有毒副作用大，預后差，易產(chǎn)生耐藥性等缺點，尋找高效低毒的治療腫瘤的方法成為腫瘤研究的熱點。腫瘤分化治療是使用誘導分化劑使腫瘤細胞分化從而阻止腫瘤的一種手段，它打破了傳統(tǒng)認為“一旦成為癌細胞，永遠是癌細胞?！钡挠^點。臨床研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的誘導分化治療不僅能夠克服放化療肝腎毒性大，使患者耐受性差，降低機體的免疫力等缺點，還能有效的提高患者的生

2、存質(zhì)量，延長患者的壽命。細胞周圍溫度是影響腫瘤細胞分化的重要因素，溫熱具有促進血液循環(huán)、增強機體免疫力、誘導腫瘤細胞凋亡等作用。上世紀七十年代發(fā)現(xiàn)，As2O3對急性粒性白血病有顯著療效，有效率可達到90％以上。研究發(fā)現(xiàn)As2O3不僅能夠有效的誘導腫瘤細胞分化，而且能夠逆轉其它誘導分化劑的多藥耐藥性。一般認為As2O3的誘導分化機制可能與降解PML-RARα融合蛋白、恢復維甲酸信號通路、抑制JAK-STAT信號通路有關，忽略了As2O3從

3、中藥藥性上為大熱性藥物的實質(zhì)。中藥熱性藥物能夠激發(fā)細胞能量代謝、營造機體“溫陽”環(huán)境。本課題以白血病為研究對象、以As2O3的中藥熱性為基礎，探究其營造的溫熱微環(huán)境在誘導白血病細胞分化中的機制，并用川烏水煎液營造的溫熱微環(huán)境和自然溫熱微環(huán)境佐證，為腫瘤誘導分化治療提供新思路。
　　本研究從體外，體內(nèi)，機制三個方面，評價溫熱微環(huán)境對白血病細胞增殖、能量代謝、自我更新、分化、自噬和衰老的影響。首先，用CD34+/CD38-抗體包被過的

4、磁珠分離器將白血病細胞分離得到白血病非干細胞（K562）和白血病干細胞（K562s）。流式細胞儀檢測分離出的兩種細胞的干性標記Nanog和Oct4的表達，軟瓊脂克隆形成實驗檢測自我更新能力。用As2O3處理兩種細胞后，Brdu摻入法檢測對增殖的影響，篩選出無毒的As2O3濃度。ATP試劑盒檢測能量產(chǎn)生、氧電極檢測耗氧量、溫度探針檢測培養(yǎng)基溫度的變化，確定As2O3創(chuàng)造了溫熱微環(huán)境。甲基纖維素細胞成球?qū)嶒灆z測自我更新能力、聯(lián)苯胺法檢測紅系

5、分化、Western blot法檢測紅系分化標志物γ-globin和CD235a的表達。為了進一步證明溫熱微環(huán)境對白血病的誘導分化作用，我們也在川烏水煎液營造的溫熱微環(huán)境和自然溫熱環(huán)境下觀察了白血病細胞的分化，ATP試劑盒檢測能量產(chǎn)生、氧電極檢測耗氧量、溫度探針檢測培養(yǎng)基溫度的變化，確定川烏水煎液創(chuàng)造了溫熱微環(huán)境。Brdu摻入法檢測增殖、甲基纖維素細胞成球?qū)嶒灆z測自我更新能力、聯(lián)苯胺法檢測紅系分化、Western blot法檢測干性標志

6、Nanog、Oct4和紅系分化標志γ-globin、CD235a。接著，建立裸鼠K562和細胞皮下移植瘤模型，評價As2O3對荷瘤小鼠皮下移植瘤的誘導分化作用。記錄荷瘤小鼠的存活率；測量小鼠體溫確定As2O3在體內(nèi)創(chuàng)造了溫熱微環(huán)境；測量瘤體積評價As2O3對腫瘤生長的影響；測自主活動評價As2O3對小鼠生存狀態(tài)的影響；Elisa法檢測荷瘤小鼠血漿凝血因子水平；血流變檢測血漿粘度；血細胞分析儀檢測血中紅細胞數(shù)、白細胞數(shù)；Western b

7、lot檢測紅系分化標志γ-globin；免疫組化檢測紅系分化標志CD235a。為了進一步證明藥物創(chuàng)造的溫熱微環(huán)境在體內(nèi)對白血病細胞的誘導分化作用，我們用川烏水煎液治療荷瘤小鼠，通過小鼠存活率、體溫、腫瘤體積、自主活動、紅白細胞數(shù)、凝血因子、血漿粘度和腋下瘤分化，觀察其創(chuàng)造的溫熱微環(huán)境是否與As2O3有相似的作用。最后，我們探索溫熱微環(huán)境誘導白血病細胞分化的機制。體外研究，用As2O3處理兩種分類后的白血病細胞，AO染色法檢測自噬、細胞免

8、疫熒光法檢測自噬相關的LC3-B和P62蛋白表達、SA-β-gal染色法檢測細胞衰老、免疫組化法檢測衰老標志物P16INK4a表達。我們在川烏水煎液營造的溫熱微環(huán)境和自然溫熱環(huán)境下對白血病細胞的分化機制進行了驗證，AO法檢測自噬，SA-β-gal染色法檢測細胞衰老，免疫組化法檢測衰老標志物P16INK4a的表達。體內(nèi)研究，評價As2O3對荷瘤小鼠瘤組織的自噬和衰老的影響，免疫組化法檢測自噬相關蛋白P62和衰老標志P16INK4a。為了進

9、一步佐證溫熱微環(huán)境對白血病的誘導分化機制，我們用川烏水煎液治療荷瘤小鼠，通過AO法檢測自噬，免疫組化法檢測衰老標志P16INK4a，觀察其創(chuàng)造的溫熱微環(huán)境是否與As2O3有相似的作用。
　　體外研究，流式細胞術表明K562s細胞的干細胞標志物Nanog、Oct4明顯高于K562細胞，軟瓊脂克隆形成實驗表明K562s細胞比K562細胞具有更強的自我更新能力。BrdU摻入法實驗結果顯示，0.5uM的As2O3無細胞毒性。ATP、耗氧量

10、、溫度檢測表明，0.5uM的As2O3使細胞耗氧量增加、使ATP減少，稍微升高培養(yǎng)基的溫度，能夠創(chuàng)造溫熱微環(huán)境。甲基纖維素細胞成球?qū)嶒灡砻鳎?.5uM的As2O3顯著抑制K562和K562s細胞的自我更新能力。聯(lián)苯胺染色法顯示，0.5uM的As2O3顯著的促進K562s細胞分化，對K562細胞沒有分化作用。Western blot結果顯示，0.5uM的As2O3顯著促進K562s細胞的紅系分化標記γ-globin和CD235a的表達，但

11、對K562細胞無影響。川烏水煎液創(chuàng)造的溫熱微環(huán)境和自然溫熱環(huán)境對兩種分類后的白血病細胞產(chǎn)生與As2O3溫熱微環(huán)境相似的結果。體內(nèi)研究，2mg/kg的As2O3組使小鼠的存活率高，狀態(tài)好，腫瘤得到控制，體溫稍微升高，血漿中凝血因子表達降低，血漿粘度下降，血中紅細胞數(shù)增多，白細胞數(shù)減少。Western blot顯示As2O3顯著促進K562s細胞皮下移植瘤的γ-globin的表達。川烏水煎液對荷瘤小鼠產(chǎn)生與2mg/kg As2O3相似的作用

12、。機制研究表明，體外0.5uM的As2O3能顯著的促進K562細胞自噬，使其直接衰老；而對K562s細胞抑制自噬，誘導其分化衰老。體內(nèi)2mg/kg As2O3也能夠顯著促進K562s細胞皮下移植瘤分化走向衰老，使K562細胞皮下移植瘤直接走向衰老。川烏水煎液驗證了As2O3溫熱微環(huán)境誘導白血病細胞分化的機制。
　　綜上所述，藥物溫熱微環(huán)境能夠誘導白血病細胞分化，其機制是在不殺傷腫瘤細胞的情況下改變K562細胞和K562s細胞的自噬