As2O3溫?zé)嵛h(huán)境誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化的機(jī)制研究.pdf

1、近年來(lái)，腫瘤在各種致死性疾病中躍居首位，嚴(yán)重影響著人類的健康。常規(guī)治療腫瘤的方法是放療和化療。放化療具有毒副作用大，預(yù)后差，易產(chǎn)生耐藥性等缺點(diǎn)，尋找高效低毒的治療腫瘤的方法成為腫瘤研究的熱點(diǎn)。腫瘤分化治療是使用誘導(dǎo)分化劑使腫瘤細(xì)胞分化從而阻止腫瘤的一種手段，它打破了傳統(tǒng)認(rèn)為“一旦成為癌細(xì)胞，永遠(yuǎn)是癌細(xì)胞?！钡挠^點(diǎn)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的誘導(dǎo)分化治療不僅能夠克服放化療肝腎毒性大，使患者耐受性差，降低機(jī)體的免疫力等缺點(diǎn)，還能有效的提高患者的生

2、存質(zhì)量，延長(zhǎng)患者的壽命。細(xì)胞周圍溫度是影響腫瘤細(xì)胞分化的重要因素，溫?zé)峋哂写龠M(jìn)血液循環(huán)、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等作用。上世紀(jì)七十年代發(fā)現(xiàn)，As2O3對(duì)急性粒性白血病有顯著療效，有效率可達(dá)到90％以上。研究發(fā)現(xiàn)As2O3不僅能夠有效的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化，而且能夠逆轉(zhuǎn)其它誘導(dǎo)分化劑的多藥耐藥性。一般認(rèn)為As2O3的誘導(dǎo)分化機(jī)制可能與降解PML-RARα融合蛋白、恢復(fù)維甲酸信號(hào)通路、抑制JAK-STAT信號(hào)通路有關(guān)，忽略了As2O3從

3、中藥藥性上為大熱性藥物的實(shí)質(zhì)。中藥熱性藥物能夠激發(fā)細(xì)胞能量代謝、營(yíng)造機(jī)體“溫陽(yáng)”環(huán)境。本課題以白血病為研究對(duì)象、以As2O3的中藥熱性為基礎(chǔ)，探究其營(yíng)造的溫?zé)嵛h(huán)境在誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化中的機(jī)制，并用川烏水煎液營(yíng)造的溫?zé)嵛h(huán)境和自然溫?zé)嵛h(huán)境佐證，為腫瘤誘導(dǎo)分化治療提供新思路。
　　本研究從體外，體內(nèi)，機(jī)制三個(gè)方面，評(píng)價(jià)溫?zé)嵛h(huán)境對(duì)白血病細(xì)胞增殖、能量代謝、自我更新、分化、自噬和衰老的影響。首先，用CD34+/CD38-抗體包被過(guò)的

4、磁珠分離器將白血病細(xì)胞分離得到白血病非干細(xì)胞（K562）和白血病干細(xì)胞（K562s）。流式細(xì)胞儀檢測(cè)分離出的兩種細(xì)胞的干性標(biāo)記Nanog和Oct4的表達(dá)，軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)自我更新能力。用As2O3處理兩種細(xì)胞后，Brdu摻入法檢測(cè)對(duì)增殖的影響，篩選出無(wú)毒的As2O3濃度。ATP試劑盒檢測(cè)能量產(chǎn)生、氧電極檢測(cè)耗氧量、溫度探針檢測(cè)培養(yǎng)基溫度的變化，確定As2O3創(chuàng)造了溫?zé)嵛h(huán)境。甲基纖維素細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)檢測(cè)自我更新能力、聯(lián)苯胺法檢測(cè)紅系

5、分化、Western blot法檢測(cè)紅系分化標(biāo)志物γ-globin和CD235a的表達(dá)。為了進(jìn)一步證明溫?zé)嵛h(huán)境對(duì)白血病的誘導(dǎo)分化作用，我們也在川烏水煎液營(yíng)造的溫?zé)嵛h(huán)境和自然溫?zé)岘h(huán)境下觀察了白血病細(xì)胞的分化，ATP試劑盒檢測(cè)能量產(chǎn)生、氧電極檢測(cè)耗氧量、溫度探針檢測(cè)培養(yǎng)基溫度的變化，確定川烏水煎液創(chuàng)造了溫?zé)嵛h(huán)境。Brdu摻入法檢測(cè)增殖、甲基纖維素細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)檢測(cè)自我更新能力、聯(lián)苯胺法檢測(cè)紅系分化、Western blot法檢測(cè)干性標(biāo)志

6、Nanog、Oct4和紅系分化標(biāo)志γ-globin、CD235a。接著，建立裸鼠K562和細(xì)胞皮下移植瘤模型，評(píng)價(jià)As2O3對(duì)荷瘤小鼠皮下移植瘤的誘導(dǎo)分化作用。記錄荷瘤小鼠的存活率；測(cè)量小鼠體溫確定As2O3在體內(nèi)創(chuàng)造了溫?zé)嵛h(huán)境；測(cè)量瘤體積評(píng)價(jià)As2O3對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響；測(cè)自主活動(dòng)評(píng)價(jià)As2O3對(duì)小鼠生存狀態(tài)的影響；Elisa法檢測(cè)荷瘤小鼠血漿凝血因子水平；血流變檢測(cè)血漿粘度；血細(xì)胞分析儀檢測(cè)血中紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞數(shù)；Western b

7、lot檢測(cè)紅系分化標(biāo)志γ-globin；免疫組化檢測(cè)紅系分化標(biāo)志CD235a。為了進(jìn)一步證明藥物創(chuàng)造的溫?zé)嵛h(huán)境在體內(nèi)對(duì)白血病細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用，我們用川烏水煎液治療荷瘤小鼠，通過(guò)小鼠存活率、體溫、腫瘤體積、自主活動(dòng)、紅白細(xì)胞數(shù)、凝血因子、血漿粘度和腋下瘤分化，觀察其創(chuàng)造的溫?zé)嵛h(huán)境是否與As2O3有相似的作用。最后，我們探索溫?zé)嵛h(huán)境誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化的機(jī)制。體外研究，用As2O3處理兩種分類后的白血病細(xì)胞，AO染色法檢測(cè)自噬、細(xì)胞免

8、疫熒光法檢測(cè)自噬相關(guān)的LC3-B和P62蛋白表達(dá)、SA-β-gal染色法檢測(cè)細(xì)胞衰老、免疫組化法檢測(cè)衰老標(biāo)志物P16INK4a表達(dá)。我們?cè)诖跛逡籂I(yíng)造的溫?zé)嵛h(huán)境和自然溫?zé)岘h(huán)境下對(duì)白血病細(xì)胞的分化機(jī)制進(jìn)行了驗(yàn)證，AO法檢測(cè)自噬，SA-β-gal染色法檢測(cè)細(xì)胞衰老，免疫組化法檢測(cè)衰老標(biāo)志物P16INK4a的表達(dá)。體內(nèi)研究，評(píng)價(jià)As2O3對(duì)荷瘤小鼠瘤組織的自噬和衰老的影響，免疫組化法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白P62和衰老標(biāo)志P16INK4a。為了進(jìn)

9、一步佐證溫?zé)嵛h(huán)境對(duì)白血病的誘導(dǎo)分化機(jī)制，我們用川烏水煎液治療荷瘤小鼠，通過(guò)AO法檢測(cè)自噬，免疫組化法檢測(cè)衰老標(biāo)志P16INK4a，觀察其創(chuàng)造的溫?zé)嵛h(huán)境是否與As2O3有相似的作用。
　　體外研究，流式細(xì)胞術(shù)表明K562s細(xì)胞的干細(xì)胞標(biāo)志物Nanog、Oct4明顯高于K562細(xì)胞，軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)表明K562s細(xì)胞比K562細(xì)胞具有更強(qiáng)的自我更新能力。BrdU摻入法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，0.5uM的As2O3無(wú)細(xì)胞毒性。ATP、耗氧量

10、、溫度檢測(cè)表明，0.5uM的As2O3使細(xì)胞耗氧量增加、使ATP減少，稍微升高培養(yǎng)基的溫度，能夠創(chuàng)造溫?zé)嵛h(huán)境。甲基纖維素細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)表明，0.5uM的As2O3顯著抑制K562和K562s細(xì)胞的自我更新能力。聯(lián)苯胺染色法顯示，0.5uM的As2O3顯著的促進(jìn)K562s細(xì)胞分化，對(duì)K562細(xì)胞沒(méi)有分化作用。Western blot結(jié)果顯示，0.5uM的As2O3顯著促進(jìn)K562s細(xì)胞的紅系分化標(biāo)記γ-globin和CD235a的表達(dá)，但

11、對(duì)K562細(xì)胞無(wú)影響。川烏水煎液創(chuàng)造的溫?zé)嵛h(huán)境和自然溫?zé)岘h(huán)境對(duì)兩種分類后的白血病細(xì)胞產(chǎn)生與As2O3溫?zé)嵛h(huán)境相似的結(jié)果。體內(nèi)研究，2mg/kg的As2O3組使小鼠的存活率高，狀態(tài)好，腫瘤得到控制，體溫稍微升高，血漿中凝血因子表達(dá)降低，血漿粘度下降，血中紅細(xì)胞數(shù)增多，白細(xì)胞數(shù)減少。Western blot顯示As2O3顯著促進(jìn)K562s細(xì)胞皮下移植瘤的γ-globin的表達(dá)。川烏水煎液對(duì)荷瘤小鼠產(chǎn)生與2mg/kg As2O3相似的作用

12、。機(jī)制研究表明，體外0.5uM的As2O3能顯著的促進(jìn)K562細(xì)胞自噬，使其直接衰老；而對(duì)K562s細(xì)胞抑制自噬，誘導(dǎo)其分化衰老。體內(nèi)2mg/kg As2O3也能夠顯著促進(jìn)K562s細(xì)胞皮下移植瘤分化走向衰老，使K562細(xì)胞皮下移植瘤直接走向衰老。川烏水煎液驗(yàn)證了As2O3溫?zé)嵛h(huán)境誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化的機(jī)制。
　　綜上所述，藥物溫?zé)嵛h(huán)境能夠誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化，其機(jī)制是在不殺傷腫瘤細(xì)胞的情況下改變K562細(xì)胞和K562s細(xì)胞的自噬