細胞酸堿內(nèi)環(huán)境對白血病細胞分化及耐藥的影響及相關(guān)機制研究.pdf

1、背景:伊馬替尼(格列衛(wèi)STI571)是目前治療CML的有效藥物。但原發(fā)或繼發(fā)性耐藥是CML尤其是急變期患者應(yīng)用伊馬替尼遇到的最大問題。為此,進一步探討和了解BCR/ABL下游的分子網(wǎng)絡(luò),尋找不依賴BCR/ABL激酶的新的有效治療靶點有望解決這一耐藥問題。
　　 目的:根據(jù)我們已報道的研究結(jié)果表明,特異性抑制鈉氫交換蛋白1(NHE1)所致的細胞內(nèi)酸化能有效逆轉(zhuǎn)P-糖蛋白(PgP)介導(dǎo)的白血病細胞多藥耐藥。而伊馬替尼已被證明是PgP

2、的底物,其介導(dǎo)的藥物外排是CML患者耐伊馬替尼的機制之一。因此本研究意在探討NHE1與Pgp在CML患者中的關(guān)系及在耐藥中的作用。
　　 方法:對2008年10月～2010年9月我院收治的CML患者19例、急性髓系白血病AML9例、急性淋巴細胞白血病ALL11例進行研究,并收集5例正常供者骨髓為陰性對照。分離骨髓單個核細胞,應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡測定患者原代白血病細胞內(nèi)pH值(Intracellular pH,pHi),實時定量R

3、T-PCR及Western blot技術(shù)檢測Pgp基因及蛋白表達,并統(tǒng)計pHi與Pgp表達的相關(guān)性。用NHE1特異性抑制劑Cariporide及高鉀緩沖溶液對細胞系進行酸化處理后,共聚焦及實時定量RT-PCR測患者細胞內(nèi)pH值以及Pgp表達水平的變化,流式細胞術(shù)和激光共聚焦顯微鏡檢測熒光染料羅丹明123(Rh123)及阿霉素(DOX)在細胞內(nèi)的蓄積,MTT及集落形成實驗考查細胞對藥物敏感性。并進一步考察Cariporide及高鉀緩沖溶液

4、對原代白血病細胞ERK1/2、ERK5、p38 MAPK、JNK磷酸化水平的改變。繼而利用NHE1抑制劑和高鉀緩沖溶液對敏感株K562及耐藥株K562/DOX,K562/G01細胞系進行處理,測定細胞內(nèi)pH值(Intracellular pH,pHi),羅丹明123(Rh123)及阿霉素(DOX)在細胞內(nèi)的蓄積,P-糖蛋白(Pgp)基因表達變化,Pgp蛋白水平以及ERK1/2、p38 MAPK、JNK磷酸化水平。進一步應(yīng)用ERK1/2、

5、p38 MAPK、JNK特異性抑制劑PD98059、SB203580、SP600125以及siRNA干擾的方法考察MAPK信號通路在該過程中的作用。
　　 結(jié)果:細胞內(nèi)pH值測定顯示,BCR-ABL陽性和陰性組細胞內(nèi)pH值均高于正常組,相關(guān)性分析顯示BCR-ABL陽性組細胞內(nèi)pH值與Pgp基因表達呈正相關(guān)(r2=0.3439),而BCR—ABL陰性組細胞內(nèi)pH值與Pgp基因表達無相關(guān)性。將BCR-ABL陽性樣本分為初治及復(fù)發(fā)組,

6、初治組細胞內(nèi)pH值平均為7.11,明顯低于復(fù)發(fā)組的7.32。與初治組相比,復(fù)發(fā)組Pgp基因及蛋白均有不同程度的過表達,用NHE1特異性抑制劑Cariporide及高鉀緩沖溶液處理患者細胞后,復(fù)發(fā)組患者細胞內(nèi)pH值水平下降,PgpmRNA和蛋白表達下調(diào),Rh123及阿霉素在細胞內(nèi)的蓄積增加,且對伊馬替尼的敏感性增強,而初治組中未見明顯變化。隨著細胞內(nèi)pH的降低,復(fù)發(fā)組p38MAPK及ERK5蛋白激酶磷酸化水平呈下降趨勢,ERK1/2及JN

7、K蛋白激酶磷酸化水平呈上升趨勢。初治組ERK1/2及JNK蛋白激酶磷酸化水平同樣呈上升趨勢,而p38 MAPK及ERK5蛋白激酶磷酸化水平未見顯著改變。Pgp高表達的耐藥株K562/DOX及K562/G01細胞的細胞內(nèi)pH值顯著高于敏感株K562細胞(P<0.05),且K562/DOX伴隨較強的Rh123及DOX外排能力。抑制NHE1活性可有效增強K562/DOX及K562/G01細胞對伊馬替尼的敏感性,并抑制細胞中Pgp基因及蛋白水平

8、的表達(P<0.05)；另外抑制NHE1活性可顯著減少K562/DOX細胞內(nèi)Rh123和DOX的外排,且具有細胞內(nèi)pH值及時間依賴性。而敏感株K562細胞中Pgp表達及藥物外排能力并不受NHE1抑制劑的影響(P>0.05)。隨著細胞內(nèi)pH的降低,K562/DOX及K562/G01細胞中p38 MAPK蛋白激酶磷酸化水平呈下降趨勢,ERK1/2蛋白激酶磷酸化水平呈上升趨勢,JNK蛋白激酶磷酸化水平呈上升趨勢。特異性的p38 MAPK抑制劑

9、SB203580可與NHE1抑制劑協(xié)同下調(diào)Pgp基因及蛋白水平的表達。另外,ERK1/2蛋白激酶抑制劑PD98059及JNK蛋白激酶抑制劑SP600125可致p38 MAPK蛋白激酶磷酸化水平上升,提示ERK1/2和JNK可能抑制p38 MAPK激酶的活性。
　　 結(jié)論:抑制NHE1活性能夠顯著降低BCR-ABL陽性患者細胞中Pgp蛋白表達和功能,增加Rh123及阿霉素在細胞中的累積,并增加細胞對伊馬替尼的敏感性,為逆轉(zhuǎn)CML耐