攜帶VEGF165基因的重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染人脂肪間充質(zhì)干細胞的實驗研究.pdf

1、本實驗以人脂肪間充質(zhì)干細胞作為基因轉(zhuǎn)染的靶細胞，構(gòu)建VEGF165重組腺病毒載體，利用重組腺病毒載體將其攜帶導(dǎo)入ADSCs中，檢測外源基因在ADSCs中的及轉(zhuǎn)染后細胞生物特性的變化。旨在通過基因轉(zhuǎn)染這一途徑將VEGF165與ADSCs結(jié)合起來，從而為探索一種更加有效的構(gòu)建組織工程化脂肪的方法，提供實驗基礎(chǔ). 目的：1、從人脂肪組織提取脂肪間充質(zhì)干細胞，了解其生物學特性；2構(gòu)建VEGF165腺病毒載體；3、以EGFP作為報告基因，

2、篩選腺病毒最佳感染復(fù)數(shù)，為進一步進行攜帶外源基因的轉(zhuǎn)染探索轉(zhuǎn)染條件；4、研究攜帶人VEGF165腺病毒載體轉(zhuǎn)染脂肪間充質(zhì)干細胞后，外源基因的表達情況；5、研究ADSCs在基因轉(zhuǎn)染前后細胞活性與增殖能力的變化，為下一步進行體內(nèi)回植提供研究基礎(chǔ)。 方法：1.采用膠原酶消化貼壁法提取人脂肪間充質(zhì)干細胞，并傳代培養(yǎng)以流式細胞術(shù)鑒定其表面標志，測定培養(yǎng)細胞的生長曲線。2.采用Ad5重組腺病毒載體以不同梯度的MOI(Multiplicity

3、 of Infection)值轉(zhuǎn)染人脂肪間充質(zhì)干細胞，以EGFP作為報告基因，熒光倒置顯微鏡觀察并用圖像分析法測定轉(zhuǎn)染效率，篩選確定最佳轉(zhuǎn)染值。3.體外培養(yǎng)并擴增人脂肪間充質(zhì)干細胞，試驗組用構(gòu)建好的AD5-VEGF165-IRES-EGFP進行基因轉(zhuǎn)染，對照組只加入培養(yǎng)液。收集各組第1、3、5、7、9、至19天的上清液，采用ELISA試劑盒測定培養(yǎng)上清液中VEGF165的濃度，各組進行比較。4.實驗組：用AD5-VEGF165-IRES

4、-EGFP進行基因轉(zhuǎn)染，陽性對照組：用AD5-EGFP空載體進行轉(zhuǎn)染；陰性對照組只加入培養(yǎng)液。用MTT法檢測各組細胞的活性，以流式細胞術(shù)檢測各組細胞的增殖活性、細胞周期。所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。 結(jié)果：1.膠原酶消化法是一種有效、方便、快捷的ADSCs分離方法，所分離的細胞能傳十代以上，具有干細胞特性，ADSCs的特異性標志陽性，不表達造血干細胞的特異性標志；流式細胞術(shù)結(jié)果CD106陰性，而CD49d陽性。2、重組腺病毒載體具有

5、較高的轉(zhuǎn)染效率，當轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)(MOI)值為400，轉(zhuǎn)染效率可達90％以上。3.ELISA法檢測培養(yǎng)細胞上清液中VEGF165，轉(zhuǎn)染組可見VGEF165高表達(3312.157±170.378)，空白對照組檢測到微量VEGF165表達：轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組間顯示顯著性差異(P<0.05)。4.經(jīng)VEGF165基因轉(zhuǎn)染的ADSCs和轉(zhuǎn)染空載體組及未轉(zhuǎn)染組吸光度值無顯著性差異(P>0.05)。經(jīng)基因轉(zhuǎn)染的ADSCs與轉(zhuǎn)染空載體、未轉(zhuǎn)染的ADSCs相

6、比較，G1期細胞所占百分比無顯著性差異，反映增殖活力的增殖指數(shù)Pr1(包括G1/G2期和M期)也無顯著性差異(P>0.05)；攜帶外源基因腺病毒轉(zhuǎn)染對細胞的活性與增殖周期無顯著影響。 結(jié)論： 1.人脂肪組織中存在具有多向分化潛能的干細胞，且含量豐富，生物學性能穩(wěn)定。膠原酶消化法可以得到相對較純的問充質(zhì)干細胞。 2.重組腺病毒載體是轉(zhuǎn)染人脂肪間充質(zhì)干細胞的較理想載體，恰當?shù)腗OI值可提高轉(zhuǎn)染效率。 3.重組