2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、本實驗以人脂肪間充質(zhì)干細胞作為基因轉(zhuǎn)染的靶細胞,構(gòu)建VEGF165重組腺病毒載體,利用重組腺病毒載體將其攜帶導(dǎo)入ADSCs中,檢測外源基因在ADSCs中的及轉(zhuǎn)染后細胞生物特性的變化。旨在通過基因轉(zhuǎn)染這一途徑將VEGF165與ADSCs結(jié)合起來,從而為探索一種更加有效的構(gòu)建組織工程化脂肪的方法,提供實驗基礎(chǔ). 目的:1、從人脂肪組織提取脂肪間充質(zhì)干細胞,了解其生物學特性;2構(gòu)建VEGF165腺病毒載體;3、以EGFP作為報告基因,

2、篩選腺病毒最佳感染復(fù)數(shù),為進一步進行攜帶外源基因的轉(zhuǎn)染探索轉(zhuǎn)染條件;4、研究攜帶人VEGF165腺病毒載體轉(zhuǎn)染脂肪間充質(zhì)干細胞后,外源基因的表達情況;5、研究ADSCs在基因轉(zhuǎn)染前后細胞活性與增殖能力的變化,為下一步進行體內(nèi)回植提供研究基礎(chǔ)。 方法:1.采用膠原酶消化貼壁法提取人脂肪間充質(zhì)干細胞,并傳代培養(yǎng)以流式細胞術(shù)鑒定其表面標志,測定培養(yǎng)細胞的生長曲線。2.采用Ad5重組腺病毒載體以不同梯度的MOI(Multiplicity

3、 of Infection)值轉(zhuǎn)染人脂肪間充質(zhì)干細胞,以EGFP作為報告基因,熒光倒置顯微鏡觀察并用圖像分析法測定轉(zhuǎn)染效率,篩選確定最佳轉(zhuǎn)染值。3.體外培養(yǎng)并擴增人脂肪間充質(zhì)干細胞,試驗組用構(gòu)建好的AD5-VEGF165-IRES-EGFP進行基因轉(zhuǎn)染,對照組只加入培養(yǎng)液。收集各組第1、3、5、7、9、至19天的上清液,采用ELISA試劑盒測定培養(yǎng)上清液中VEGF165的濃度,各組進行比較。4.實驗組:用AD5-VEGF165-IRES

4、-EGFP進行基因轉(zhuǎn)染,陽性對照組:用AD5-EGFP空載體進行轉(zhuǎn)染;陰性對照組只加入培養(yǎng)液。用MTT法檢測各組細胞的活性,以流式細胞術(shù)檢測各組細胞的增殖活性、細胞周期。所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。 結(jié)果:1.膠原酶消化法是一種有效、方便、快捷的ADSCs分離方法,所分離的細胞能傳十代以上,具有干細胞特性,ADSCs的特異性標志陽性,不表達造血干細胞的特異性標志;流式細胞術(shù)結(jié)果CD106陰性,而CD49d陽性。2、重組腺病毒載體具有

5、較高的轉(zhuǎn)染效率,當轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)(MOI)值為400,轉(zhuǎn)染效率可達90%以上。3.ELISA法檢測培養(yǎng)細胞上清液中VEGF165,轉(zhuǎn)染組可見VGEF165高表達(3312.157±170.378),空白對照組檢測到微量VEGF165表達:轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組間顯示顯著性差異(P<0.05)。4.經(jīng)VEGF165基因轉(zhuǎn)染的ADSCs和轉(zhuǎn)染空載體組及未轉(zhuǎn)染組吸光度值無顯著性差異(P>0.05)。經(jīng)基因轉(zhuǎn)染的ADSCs與轉(zhuǎn)染空載體、未轉(zhuǎn)染的ADSCs相

6、比較,G1期細胞所占百分比無顯著性差異,反映增殖活力的增殖指數(shù)Pr1(包括G1/G2期和M期)也無顯著性差異(P>0.05);攜帶外源基因腺病毒轉(zhuǎn)染對細胞的活性與增殖周期無顯著影響。 結(jié)論: 1.人脂肪組織中存在具有多向分化潛能的干細胞,且含量豐富,生物學性能穩(wěn)定。膠原酶消化法可以得到相對較純的問充質(zhì)干細胞。 2.重組腺病毒載體是轉(zhuǎn)染人脂肪間充質(zhì)干細胞的較理想載體,恰當?shù)腗OI值可提高轉(zhuǎn)染效率。 3.重組

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