神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞中脂肪酸β-氧化和膽固醇代謝相關(guān)基因mRNA的表達(dá).pdf

1、目的：極長鏈脂肪酸(VLCFA)是對細(xì)胞有毒的物質(zhì)，經(jīng)過氧化物酶體β-氧化途徑分解解毒。途經(jīng)中的酶缺陷的病人，以及該酶基因敲除的大鼠，VLCFA都在腦中積聚，影響神經(jīng)元的遷移，引起脫髓鞘，對神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生毒性，從而導(dǎo)致新生兒腦畸形或腦發(fā)育不良。高膽固醇也是阿爾茨海默病發(fā)生發(fā)展的危險因素。但是，目前對中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的脂肪酸和膽固醇代謝還知之甚少，因而研究組成腦組織的膠質(zhì)細(xì)胞中與脂肪酸、膽固醇代謝相關(guān)基因的表達(dá)具有重要的理論和實際意

2、義。 脂肪酸β-氧化主要在線粒體和過氧化物酶體中進(jìn)行。線粒體主要氧化短鏈和中長鏈的脂肪酸。肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶Ⅰ (CPT-1)是線粒體脂肪酸β-氧化的限速酶。過氧化物酶體主要氧化VLCFA。參與過氧化物酶體脂肪酸β-氧化的酶包括脂酰CoA氧化酶1(Acox1)、脂酰CoA氧化酶2(Acox2)、脂酰CoA氧化酶3(Acox3)、L-雙功能蛋白(LBP)、D-雙功能蛋白(DBP)、硫解酶A(THLA)、硫解酶B(THLB)和固醇攜帶蛋

3、白x(SCPx)。研究表明Acox1、DBP和T肌A在大鼠腦組織有表達(dá)，其中DBP在神經(jīng)元表達(dá)。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)細(xì)胞中的重要群體，起營養(yǎng)、支持和協(xié)助神經(jīng)元的作用。腦膠質(zhì)瘤是起源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的腫瘤。在大腦組織表達(dá)的與脂肪酸代謝有關(guān)的基因，是否在膠質(zhì)細(xì)胞中有表達(dá)? 與過氧化物酶體脂肪酸β-氧化相關(guān)的酶的基因中有哪些基因也在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)?膠質(zhì)瘤細(xì)胞中這些相關(guān)基因的表達(dá)是否與膠質(zhì)細(xì)胞一樣?未見報道。調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂肪酸代謝的過氧化物

4、酶體增殖物激活受體α(PPARa)在神經(jīng)元有表達(dá)，但在膠質(zhì)細(xì)胞是否有表達(dá)?未見報道。因此，本實驗在成功培養(yǎng)皮質(zhì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的基礎(chǔ)上，分別測定了膠質(zhì)細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞中PPAR<,α>、CPT-1、Acox1、Acox2、Acox3、DBP、LBP、THLA、THLB、SCPx mRNA的表達(dá)，以探討脂肪酸在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的代謝機(jī)制和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在CNS中的功能。 成年鼠腦的膽固醇主要在膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)合成，羥甲基戊二酸單酰C

5、oA還原酶(HMGR)是膽固醇合成的限速酶。膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的膽固醇與其細(xì)胞膜上ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1(ABCA1)結(jié)合，被呈遞到胞外載脂蛋白上。神經(jīng)元膜上B類I型清道夫受體(SR-BI)攝入載脂蛋白上的膽固醇。神經(jīng)元內(nèi)，膽固醇24S-羥化酶(CYP46)可催化膽固醇生成24S-羥膽固醇，進(jìn)而通過血腦屏障進(jìn)入血液循環(huán)，入肝轉(zhuǎn)化成膽汁酸后排出體外。調(diào)節(jié)膽固醇代謝的肝X受體(LXRn)也在腦組織中表達(dá)。我室以前的研究也表明，在腦組織中表達(dá)的LXR

6、<,α>、HMGR、CYP46、ABCA1和SR-BI基因，既在神經(jīng)元也在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。但在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中這些基因的表達(dá)如何?未見報道。鑒于此，我們測定了原代培養(yǎng)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞中LXR<,α>、HMGR、CYP46、ABCA1和SR-BI轉(zhuǎn)錄的表達(dá)水平，以探討膠質(zhì)瘤細(xì)胞中膽固醇的代謝機(jī)制，為研究脂類代謝與膠質(zhì)瘤的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。 方法： 1、皮質(zhì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)取新生3天的SD大鼠斷頭取腦置DMEM中

7、。鈍性剝出皮質(zhì)并將皮質(zhì)剪成1mm<'3>小塊，移入消化液(0.125％胰蛋白酶，pH 7.4 PBS配制)中，放入37℃培養(yǎng)箱中消化30min。待組織塊下沉后棄去上清，加入等體積種植液(含10％標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清和100u/ml青、鏈霉素的DMEM)終止消化10min并洗滌兩次。再加入等體積種植液，用尖端經(jīng)火焰刨光的Pasteur吸管緩慢吹打25次左右使組織團(tuán)塊完全消失，吸出上層單細(xì)胞懸液，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10<'6>/ml，接種于L

8、-多聚賴氨酸處理的6孔培養(yǎng)板中，每孔1ml。置37℃，5％CO<,2>及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。以后每3天換培養(yǎng)液(含10％標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清和100u/ml青、鏈霉素的DMEM)一次。 2、C6細(xì)胞的培養(yǎng)用RPMI1640培養(yǎng)液常規(guī)傳代培養(yǎng)，取第10～15代細(xì)胞用于本實驗。 3、分組 分為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞組(Glia)和膠質(zhì)瘤細(xì)胞組(C6)。 4、皮質(zhì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定用膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)抗體進(jìn)行免

9、疫細(xì)胞化學(xué)染色來鑒定膠質(zhì)細(xì)胞的性狀與純度。 5、細(xì)胞總RNA的提取用Trizol一步法提取。 6、mRNA表達(dá)的定量用GAPDH作為內(nèi)參照，利用RT-PCR法測定原代培養(yǎng)的膠質(zhì)細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞中PPAR<,α>、LXR<,α>、CPT-1、CAT、Acox1、Acox2、Acox3、DBP、LBP、THLA、THLB、SCPx、HMGR、CYP46、ABCA1和SR-BI的相對表達(dá)量。 結(jié)果： 1、皮質(zhì)神

10、經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察相差顯微鏡下觀察，細(xì)胞在接種12h后大部分貼壁，圓形或橢圓形，光暈明顯，部分細(xì)胞有小突起伸出，細(xì)胞分散均勻。培養(yǎng)第3～4 d，細(xì)胞生長迅速，形成群落，可見較多的核分裂相，細(xì)胞體積和數(shù)量增加，突起增多，單個的膠質(zhì)細(xì)胞胞體較大，胞核明顯，呈圓形或卵圓形，偏于胞體一側(cè)，周圍可見混雜生長的少數(shù)神經(jīng)元。培養(yǎng)第6～7 d，星形膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)出多邊形和纖維形兩種形態(tài)，群落之間開始融合成片，形成以星形膠質(zhì)細(xì)胞為主的地毯樣地層。隨著培

11、養(yǎng)時間延長，神經(jīng)元開始退化并漂浮于培養(yǎng)液中。培養(yǎng)第13～14 d，少突膠質(zhì)細(xì)胞開始生長，體積小，折光性強(qiáng)，有細(xì)小突起沿胞體呈放射狀分布，位于表層，而底層的星形膠質(zhì)細(xì)胞群落之間完全融合并鋪滿板底。 2、免疫細(xì)胞化學(xué)染色用膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色來鑒定膠質(zhì)細(xì)胞的性狀與純度，結(jié)果表明星型膠質(zhì)細(xì)胞占培養(yǎng)細(xì)胞的85％，能夠滿足我們的實驗要求。 3、細(xì)胞中CAT mRNA相對表達(dá)量的變化Glia組和C6

12、組均有CAT mRNA的表達(dá)；且兩組間的差別(2.406±0.318 vs 2.578±0.221)無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。表明膠質(zhì)細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞中都存在過氧化物酶體。 4、細(xì)胞中CPT-I mRNA相對表達(dá)量的變化Glia組和C6組均有CPT-1 mRNA的表達(dá)；C6組CPT-1mRNA的相對表達(dá)量(2.371±0.294)明顯高于Glia組(1.364±0.232，P<0.01)。表明膠質(zhì)瘤細(xì)胞中線粒體β-氧化高于膠

13、質(zhì)細(xì)胞。 5、細(xì)胞中Acox1、Acox2和Acox3 mRNA相對表達(dá)量的變化Glia組有Acox1和Acox2 mRNA的表達(dá)而無Acox3mRNA的表達(dá)；C6組有Acox1和Acox3 mRNA的表達(dá)而無Acox2 mRNA的表達(dá)；且C6組Acox1 mRNA的相對表達(dá)量(2.777±0.342)明顯高于Glia組(1.873±0.240，P<0.01)。 6、細(xì)胞中DBP和LBP mRNA相對表達(dá)量的變化Gli

14、a組和C6組均有DBP mRNA的表達(dá)而無LBP mRNA的表達(dá)；且兩組間差別(0.919±0.128 vs 1.079±0.207)無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 7、細(xì)胞中THLA、THLB和SCPx mRNA相對表達(dá)量的變化Glia組有THLA和SCPx mRNA的表達(dá)而無THLBmRNA的表達(dá)；C6組有THLA和THLB mRNA的表達(dá)而無SCPx的表達(dá)；且THLAmRNA在兩組間的差別(0.188±0.024 VS 0

15、.187±0.031)無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 8、細(xì)胞中PPARa mRNA相對表達(dá)量的變化Glia組和C6組均有PPARa mRNA的表達(dá)；C6組PPARamRNA的相對表達(dá)量(1.064±0.121)明顯高于Glia組(0.463+0.091，P<0.01)。 9、細(xì)胞中LXRa mRNA相對表達(dá)量的變化Glia組和C6組均有LXRa mRNA的表達(dá)；且兩組間的差別(0.734±0.147 vs 0.746+

16、0.134)無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 10、細(xì)胞中HMGR mRNA相對表達(dá)量的變化Glia組和C6組均有HMGR mRNA的表達(dá)；C6組HMGRmRNA的相對表達(dá)量(2.324±0.100)明顯高于Glia組(1.175±0.189，JF)

17、中ABCA1和SR-BI mRNA相對表達(dá)量的變化Glia組和C6組均有ABCA1和SR-BI mRNA的表達(dá)；C6組SR-BI mRNA的相對表達(dá)量(1.778±0.214)明顯高于Glia組(1.107±0.185，P<0.01)；ABCA1 mRNA的表達(dá)在兩組間的差別(1.397±0.270 vs 1.255±0.227)無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。 結(jié)論： 1、過氧化物酶體氧化不飽和直鏈VLCFA和支鏈VLC