八肋游仆蟲中心蛋白性質(zhì)及功能的研究.pdf

1、生命細(xì)胞中存在著一個(gè)精密的骨架系統(tǒng)，保證了細(xì)胞正常的形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能，而微管組織中心(microtubule organizing centre，MTOC)充當(dāng)著細(xì)胞骨架總設(shè)計(jì)師的角色。不同種屬細(xì)胞在MTOC的名稱上有也有一定的差異。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，MTOC被稱做中心體，它隨細(xì)胞周期進(jìn)行復(fù)制、分離，并且在分裂期形成紡錘體的兩極，是細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)中心，中心體是一個(gè)高度動(dòng)態(tài)變化的結(jié)構(gòu)。每一個(gè)中心體均包括兩個(gè)相互垂直的中心粒(centriole

2、)和中心粒周圍物質(zhì)(pericentriolar material，PCM)。PCM的主要成分是蛋白質(zhì)，中心蛋白即是其中的一種。游仆蟲中心蛋白是由168個(gè)氨基酸組成的單肽鏈酸性蛋白，屬于鈣離子結(jié)合蛋白家族成員。它含有四個(gè)螺旋-環(huán)-螺旋(helix-loop-helix)結(jié)構(gòu)域，即所謂的EF-hand結(jié)構(gòu)域，每個(gè)結(jié)構(gòu)域均可結(jié)合一個(gè)鈣離子。中心蛋白與鈣調(diào)蛋白具有高度的序列同源性，其三維結(jié)構(gòu)也可能相類似，整個(gè)分子呈啞鈴型構(gòu)象，氨基端和羧基端分

3、別為啞鈴的兩頭，各含兩個(gè)EF手結(jié)構(gòu)域，中間由一段8個(gè)氨基酸殘基組成的彈性α-螺旋相連。
　　本研究利用基因重組技術(shù)，在已有八肋游仆蟲中心蛋白基因的基礎(chǔ)上，構(gòu)建得到了半分子中心蛋白基因(N-EoCen、SC-EoCen、LC-EoCen)的重組表達(dá)質(zhì)粒和帶有突變位點(diǎn)G151W的重組質(zhì)粒。分別為①pGEX-6p-N-EoCen、②pGEX-6p-SC-EoCen、③pGEX-6p-LC-EoCen、④pGEX-6p-M-EoCen(G

4、151W)、⑤pGEX-6p-M-SC-EoCen(G151W)、⑥pGEX-6p-M-LC-EoCen(G151W)。并且將這些重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌(E.coli) BL21中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得了中心蛋白的可融性表達(dá)，經(jīng)GST親和層析、陰離子交換層析和分子篩層析多步純化得到了純度較高的蛋白。為游仆蟲中心蛋白的化學(xué)性質(zhì)以及生物功能研究準(zhǔn)備了必要的材料。
　　通過圓二色譜和熒光光譜研究了中心蛋白與金屬離子(Ca2+、Tb3+)之間

5、的相互作用。研究發(fā)現(xiàn)金屬離子與中心蛋白結(jié)合引起蛋白的二極結(jié)構(gòu)以及高級(jí)結(jié)構(gòu)改變。金屬離子存在時(shí)中心蛋白的疏水性結(jié)構(gòu)域外露，可能蛋白從關(guān)閉式狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殚_放式狀態(tài)。蛋白的酪氨酸殘基與Tb3+之間發(fā)生無輻射能量轉(zhuǎn)移而使Tb2+熒光得以敏化和Ca2+競(jìng)爭(zhēng)Tb3+猝滅該敏化熒光的事實(shí)表明Ca2+、Tb3+與中心蛋白的結(jié)合位點(diǎn)為同一位點(diǎn)，而且結(jié)合順序一致，即金屬離子優(yōu)先占據(jù)C-端結(jié)構(gòu)域的第Ⅳ部位、其次為Ⅲ部位、最后為N端結(jié)構(gòu)域的Ⅰ、Ⅱ部位。由蛋白質(zhì)結(jié)

6、合鋱的熒光敏化求得了鋱離子與中心蛋白不同金屬離子結(jié)合部位間的結(jié)合常數(shù)，分別是:Ka(Ⅳ)=1.23×108 M-1和Ka(Ⅰ、Ⅱ)=2.01×106 M-1。通過鈣對(duì)鋱熒光的競(jìng)爭(zhēng)性猝滅測(cè)得鈣與中心蛋白質(zhì)的結(jié)合常數(shù)分別為:Ka(Ⅳ)=6.82×105 M-1和Ka(Ⅰ、Ⅱ)=1.13×103 M-1。
　　以蜂毒素(melittin)作為模擬靶肽，通過圓二色譜、非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、紫外光譜、熒光光譜研究了EoCen、N-EoC

7、en、SC-EoCen、LC-EoCen與蜂毒素之間的相互作用。發(fā)現(xiàn)只有EoCen和SC-EoCen可以與蜂毒素結(jié)合。C端結(jié)構(gòu)域是蛋白與蜂毒素作用的靶位點(diǎn)。Melittin與中心蛋白以一種依賴于金屬離子的模式相互作用形成1∶1復(fù)合物，其結(jié)合常數(shù)約為107 M-1。蜂毒素與中心蛋白結(jié)合，其分子轉(zhuǎn)動(dòng)速度變慢，熒光偏振相應(yīng)增大。金屬離子(Ca2+、Tb3+)與蛋白結(jié)合引起EoCen溶液構(gòu)象變化，蛋白疏水性結(jié)構(gòu)域外露，模擬靶肽的色氨酸殘基深埋在

8、該疏水性結(jié)構(gòu)內(nèi)部。同時(shí)，melittin由原來的無規(guī)則結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N單螺旋結(jié)構(gòu)。
　　通過熒光共振光散射、pull-down、非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳以及酵母雙雜交方法，從體內(nèi)、體外兩個(gè)角度研究了游仆蟲中心蛋白的聚合特性。研究發(fā)現(xiàn)金屬離子(Ca2+、Tb3+)在EoCen聚合中起著重要作用。可能結(jié)合金屬離子的中心蛋白所呈現(xiàn)的構(gòu)象有利于蛋白形成聚合體。EoCen的聚合不僅僅與蛋白N端的前20幾個(gè)氨基酸密切相關(guān)，蛋白的C端結(jié)構(gòu)域在蛋白

9、聚合過程中也起著一定的作用。與已經(jīng)報(bào)道的人中心蛋白聚合模式不同，游仆蟲中心蛋白以一種N端與N端、C端與C端結(jié)構(gòu)域(N-to-N和C-to-C)相互作用的模式形成聚合體。在中心蛋白的聚合中，靜電作用力以及疏水性作用力等次級(jí)鍵可能起著重要作用。
　　在0.1 M Hepes、pH7.4條件下，圓二色譜、熒光光譜表明鎂離子對(duì)游仆蟲中心蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以及高級(jí)結(jié)構(gòu)有一定的影響，推測(cè)該蛋白除了能與Ca2+結(jié)合外，還能與Mg2+結(jié)合。Mg2+、C

10、a2+可以與蛋白高親和部位競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，而Mg2+對(duì)Ca2+與蛋白低親和部位的結(jié)合影響不大，即蛋白質(zhì)的高親和部位(EF-handⅣ)可能是Ca2+/Mg2+混合結(jié)合位點(diǎn)。Ca2+與蛋白結(jié)合使其疏水結(jié)構(gòu)域外露，而Mg2+與蛋白結(jié)合后該疏水結(jié)構(gòu)域更傾向于包結(jié)在蛋白內(nèi)部，可能是由Ca2+/Mg2+與蛋白作用后形成不同的空間結(jié)構(gòu)所致。Mg2+存在條件下，鈣離子誘導(dǎo)的蛋白疏水結(jié)構(gòu)域的暴露程度明顯減小導(dǎo)致EoCen與模擬靶肽蜂毒素(melittin)