博萊霉素致肺纖維化小鼠肺組織中P65、α-SMA的表達及意義.pdf

1、肺間質(zhì)性肺疾病(ILD)是由200余種疾病組成的一類疾病，他們在臨床表現(xiàn)、實驗室和病理學改變上具有一定共同特點，但又有各自不同的特征。肺纖維化的典型病理學過程為肺泡上皮損傷，炎性細胞聚集，成纖維細胞過度增殖，細胞外基質(zhì)沉積，成纖維細胞增殖灶，以及蜂窩肺的形成。 博萊霉素可導(dǎo)致嚙齒類動物急性肺損傷和肺纖維化，這一特點為研究肺間質(zhì)纖維化提供了成熟的動物模型。核因子-k B(NF-kB)是重要的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)許多炎癥性細胞因子的轉(zhuǎn)錄，

2、P65是其重要的功能亞單位。研究顯示，在BLM誘導(dǎo)的肺間質(zhì)纖維化病理過程中，NF-kB的表達明顯增強。成纖維細胞分化為表達α-平滑肌動蛋白的肌成纖維細胞在肺間質(zhì)纖維化病理過程中具有重要作用。本實驗以博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型為研究對象，應(yīng)用免疫組織化學方法，旨在闡明NF-kB P65、α-平滑肌動蛋白(α-SMA)在肺纖維化發(fā)生發(fā)展中的動態(tài)變化，揭示NF-kB活化與α-SMA蛋白表達的相關(guān)性，研究NF-kB活化在成纖維細胞向肌成纖維

3、細胞轉(zhuǎn)化過程中的作用，從而探討肺間質(zhì)纖維化的發(fā)病機理，為其治療提供新的治療靶點和理論實驗依據(jù)。 材料與方法: 一、實驗材料 8周齡雌性C57BL/6小鼠(體重17～20克)，無特殊病原體SPF級(北京維通利華實驗動物技術(shù)公司)，寄養(yǎng)于中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院動物中心，博萊霉素A2(BLM-A2)15毫克/支(日本化藥株式會社，批號：H20040205)，小鼠抗人NF-kB P65單克隆抗體，小鼠抗人α-SMA單克

4、隆抗體(美國Santa Cruz公司)，即用型SP免疫組化試劑盒及DAB顯色劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。 二、實驗動物模型的建立、分組與標本處理 1、實驗動物模型建立、分組 將60只C57BL/6雌性小鼠隨機分為實驗組與對照組。所有實驗小鼠均用10％水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉后，無菌手術(shù)暴露氣管進行模型制作。實驗組(BLM組)：50只，第0天向每只小鼠氣管內(nèi)分別注射20ul含BLM-A2(5m

5、g/kg)的無菌生理鹽水。對照組：10只，第0天氣管內(nèi)注入生理鹽水20ul。 2、標本的采集與處理 在實驗的第1、3、7、14、28天對實驗組取材，每次隨機選取10只。第7、14天對對照組取材，每次隨機選取5只。以腹腔主動脈放血法處死實驗小鼠，留取肺組織。將左肺完整取出，放入4％多聚甲醛中固定3 h，常規(guī)石蠟包埋，制成4μm厚的組織切片。 三、肺組織常規(guī)病理分析 1、常規(guī)病理肺組織經(jīng)不同濃度酒精常規(guī)脫蠟至

6、水，行HE染色和Masson染色。 2、肺泡炎癥及纖維化程度的組織病理學評分方法依照Szapiel法確定肺泡炎癥及纖維化程度，兩者均分4級，分別記為1、2、3、4分。 四、實驗方法及檢測指標 應(yīng)用免疫組織化學技術(shù)(SP法)，檢測肺組織內(nèi)NF-κB P65、α-SMA蛋白的定位及表達。 五、統(tǒng)計學分析 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示，計量資料組間比較采用獨立樣本t

7、檢驗，組內(nèi)不同時間點比較采用單因素方差分析，單因素相關(guān)分析采用spearson相關(guān)分析法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 實驗結(jié)果: 一、肺組織的病理變化 肺組織病理HE染色顯示，對照組未見明顯的炎癥細胞及大片實變改變。實驗組小鼠經(jīng)氣管注射BLM后第3天，可見肺泡壁略增寬，肺泡腔和肺間質(zhì)內(nèi)有炎性細胞滲出；第7天，肺泡間隔增厚，局部肺泡萎陷，肺泡腔內(nèi)可見滲出改變，內(nèi)有大量炎癥細胞浸潤；第14、28天肺泡炎開始消退

8、，肺泡間隔明顯增厚，大量肺泡萎陷，結(jié)構(gòu)破壞，形成多發(fā)片狀實變，實變組織內(nèi)可見大量細胞浸潤。 Masson三色染色提示，對照組肺組織含有少量膠原纖維，為ECM的主要組成部分。模型組小鼠早期(第7天)即出現(xiàn)膠原纖維沉積，后期隨時間推移，膠原纖維沉積逐漸增多，纖維化程度逐漸加重，28天時可見在大片實變組織內(nèi)出現(xiàn)大量的膠原沉積，形成典型的間質(zhì)纖維化改變。 二、肺泡炎癥及纖維化程度的病理學評分結(jié)果 1、肺泡炎癥程度病理學評

9、分 氣管注射博萊霉素后各時間點，肺泡炎癥評分與對照組比較均有統(tǒng)計學意義。第7天肺泡炎病理評分最高，為3.6±0.52。 2、肺纖維化程度評分 氣管注射博萊霉素后，第7天開始形成纖維化，隨時間的延長，肺組織纖維化的程度逐漸加重。28天后，肺纖維化病理評分為3.8±0.42，肺纖維化病理改變最明顯。 三、肺組織NF-κB P65和α-SMA的免疫組化染色結(jié)果 1、肺組織NF-κB P65免疫組化染色結(jié)

10、果 在實驗組小鼠肺組織中，可見巨噬細胞、肺泡上皮細胞、支氣管黏膜上皮細胞及血管內(nèi)皮細胞P65免疫組化染色呈陽性，且可見多數(shù)胞核呈陽性表達。正常對照組小鼠肺組織上述細胞僅部分胞漿呈弱陽性染色，未見細胞核著色，且第7天與第14天比較無差異。實驗組各時間點的P65表達均較正常對照組明顯升高。氣管注射BLM后第1天，表達水平明顯高于3天、7天、14天和28天，第3天表達較第1天降低，并呈逐漸下降趨勢，但28天仍明顯高于對照組。

11、2、肺組織α-SMA免疫組化染色結(jié)果 在正常對照組小鼠肺組織中，α-SMA僅在較大血管、支氣管壁的平滑肌細胞的胞漿中呈明顯的陽性表達。實驗組則除支氣管平滑肌細胞、血管平滑肌細胞外，還可在肺間質(zhì)細胞的胞漿中見到表達。氣管注射BLM后，各時間點與對照組比較，α-SMA蛋白的表達均明顯增強，且隨時間的推移進一步增高，14和28天表達最強。 四、NF-κB P65和α-SMA表達的相關(guān)性分析 氣管注射BLM后早期(0～3