含XV類半胱氨酸骨架的芋螺毒素家族的發(fā)現(xiàn)、進(jìn)化分析和功能研究.pdf

1、芋螺是生活在熱帶海域淺水區(qū)的肉食性的海洋軟體動(dòng)物。它們利用毒液中雞尾酒樣的混合毒素(芋螺毒素)捕食、防御和競(jìng)爭(zhēng)。芋螺毒素能特異地作用于神經(jīng)系統(tǒng)的電壓門控和配體門控離子通道的不同亞型和遞質(zhì)受體，因而被廣泛用作神經(jīng)生物學(xué)研究的離子通道和受體研究工具藥物，有些被直接開發(fā)成臨床藥物和診斷試劑。 芋螺毒素雖然高度變異，種類繁多，但是到目前為止，它們共用非常有限的14種半胱氨酸骨架。我們從中國(guó)南海食蟲芋螺信號(hào)芋螺(C.litterarus)

2、毒管cDNA表達(dá)文庫EST序列分析中發(fā)現(xiàn)一個(gè)編碼典型芋螺毒素前體肽結(jié)構(gòu)的cDNA序列，成熟肽區(qū)含有8個(gè)半胱氨酸，且排布方式不同于已經(jīng)發(fā)表的任何一類半胱氨酸骨架，根據(jù)現(xiàn)有的芋螺毒素命名原則，我們將這一種新類型的骨架命名為骨架XV，該新的芋螺毒素被命名為L(zhǎng)t15.1。根據(jù)Lt15.1的前體肽編碼序列設(shè)計(jì)引物從另外兩個(gè)食蟲芋螺物種C.betu1inus和C.emaciatus毒管cDNA一鏈中克隆到與Lt15.1屬于同家族的兩個(gè)序列Bt15.

3、1和Ec15.1，從而證實(shí)了一個(gè)新的芋螺毒素半胱氨酸骨架XV(-C-C-CC-C-C-C-C-)在芋螺中的廣泛存在。 對(duì)GenBank公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast同源序列搜索發(fā)現(xiàn)XV類芋螺毒素的信號(hào)肽部分與四環(huán)芋螺毒素(現(xiàn)在定義的O超家族)中的MEKL家族具有很高的相似性，采用RT-PCR的方法從發(fā)現(xiàn)Lt15.1序列的信號(hào)芋螺中分離到兩個(gè)MEKL家族成員Lt7.1和Lt7.2。利用GenBank中的四環(huán)毒素序列，綜合我們克隆到的三個(gè)

4、XV類骨架芋螺毒素和MEKL家族成員Lt7.1和Lt7.2前體肽序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析。進(jìn)化樹結(jié)果表明四環(huán)毒素聚成三個(gè)大類，XV類芋螺毒素與MEKL家族聚在一個(gè)大支，顯示XV類芋螺毒素與MEKL家族之間存在較近親緣關(guān)系，而與四環(huán)芋螺毒素其他三個(gè)家族進(jìn)化距離較遠(yuǎn)。 取Lt15.1、Bt15.1和Ec15.1成熟肽構(gòu)建了硫氧還蛋白(TRX)融合表達(dá)載體，在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行了原核表達(dá)。以0.1mMIPTG做誘導(dǎo)劑18℃2過

5、夜誘導(dǎo)表達(dá)12小時(shí)成功獲得了三種可溶的重組融合蛋白rTRX-lt15a，rTRX-bt15a和rTRX-ec15a。采用Ni2+螯和親和層析對(duì)三種融合蛋白進(jìn)行了初步純化，獲得了約90％純度的重組融合蛋白。親和層析純化后的rTRX-lt15a再經(jīng)過弱陰離子交換層析(DEAEsepharoseionexchangeFF)純化后獲得了電泳單一條帶的融合蛋白。rTRX-lt15a經(jīng)3C酶切后采用SephadexG-50進(jìn)一步純化獲得了酶切后的目

6、的蛋白rlt15a，經(jīng)電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)鑒定，分子量與理論計(jì)算值4413.0D相符合。采用全細(xì)胞膜片鉗記錄模式研究了rlt15a對(duì)急性分離大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元上的鈉電流的影響。結(jié)果表明4μM的毒素濃度與細(xì)胞孵育15min能抑制72％鈉離子峰值電流。電流-電壓曲線表明rlt15a不能改變鈉通道的激活電壓，但能降低通道的峰值電流和翻轉(zhuǎn)電位。rlt15a作用時(shí)程曲線表明隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制程度越來越高，呈時(shí)間依賴性質(zhì)。進(jìn)