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文檔簡介
1、光通過多種光受體調節(jié)植物的生長發(fā)育,這些光受體包含光敏色素與隱花色素。擬南芥隱花色素CRY1(CRYPTOCHROME1)作為藍光信號受體蛋白,已有許多的研究報道了其在植物藍光信號轉導途徑方面的功能,如抑制下胚軸的伸長,控制幼苗的去黃化、生物鐘節(jié)律,促進植物花青素的積累,影響葉片形態(tài)和開花時間等。CRY1蛋白通過與其下游的信號蛋白相互作用,啟動藍光信號的傳遞,從而促進植物光形態(tài)的建成。目前光受體調節(jié)光形態(tài)建成的機制已得到廣泛的研究,但是
2、擬南芥隱花色素CRY1調節(jié)光形態(tài)建成的信號傳導機制目前仍不清楚。研究發(fā)現(xiàn)了許多參與CRY1藍光信號轉導并相互作用的蛋白,但轉錄因子蛋白參與CRY1藍光信號通路的研究報道目前幾乎沒有。為了更好地了解和完善CRY1藍光信號轉導機制,本研究通過酵母雙雜交的方法,用CRY1作為誘餌篩選轉錄因子酵母庫,獲得與CRY1相互作用并可能介導CRY1參與擬南芥光形態(tài)建成的轉錄因子蛋白。具體研究結果如下:
通過多次的酵母雙雜交(yeast two
3、 hybrid assay)試驗反復驗證以及雙分子熒光互補BiFC(Bimolecular Fluorescence Complementation assay)和免疫共沉淀 co-IP(co-immunoprecipitation)試驗的進一步驗證,證明CRY1與初步篩選到的轉錄因子蛋白TCP2(TEOSINTE-LIKE1, CYCLO IDEA, and PROLIFERATING CELL FACTOR2)相互作用。通過煙草和擬
4、南芥中亞細胞定位試驗,證明TCP2是一個核蛋白,其可能是與細胞核中的CRY1蛋白相互作用。本研究首次發(fā)現(xiàn)并證明了與CRY1直接相互作用的轉錄因子蛋白-TCP2,其相互作用在酵母細胞以及煙草細胞中表現(xiàn)出明顯的藍光特異性,而在擬南芥細胞中其藍光特異性依賴特征消失,推測可能是由于酵母及煙草系統(tǒng)中無擬南芥蛋白,而實際相互作用中可能存在其他擬南芥蛋白參與CRY1與TCP2的相互作用。
通過生物信息學分析CRY1與TCP2的蛋白結構域,分
5、段克隆CRY1和TCP2的多個結構域片段并通過酵母雙雜交以及BiFC的方法,證明CRY1N端結構域(該結構域包含1-515的氨基酸序列,涵蓋了光裂解酶結構域PHR)能與TCP2的特征結構域TCP(該區(qū)域包含TCP21-174氨基酸序列)相互作用。TCP結構域中的R結構域影響其與CRY1在酵母細胞中相互作用的藍光依賴性。
遺傳學研究結果表明,TCP2藍光依賴性地抑制擬南芥下胚軸的伸長,這種藍光特異性不僅表現(xiàn)在光波長的特異性上還表
6、現(xiàn)為光強度的特異性依賴;其在紅光和藍光下能調控擬南芥幼苗的子葉形態(tài),而在遠紅光下無此功能;其功能缺失突變體具有晚花的表型;我們的研究結果也進一步驗證了TCP2蛋白調控葉片形態(tài)和大小方面的功能。
鑒于光作為環(huán)境影響因子在影響植物細胞內蛋白的表達以及CRY1在藍光信號轉導途徑上的重要性,我們研究了TCP2蛋白在缺失CRY1與否的情況下對于不同光響應而做出的表達水平變化。通過免疫印跡試驗檢測Myc-TCP2/WT和Myc-TCP2/
7、cry1轉基因材料中TCP2的蛋白變化,結果證明TCP2是一個光響應的蛋白,其會在藍光下大幅積累而在黑暗和遠紅光下降解,紅光下也會有積累但積累的量和速率遠不及藍光下;同時,CRY1的缺失會影響到TCP2蛋白的穩(wěn)定以及積累速度。蛋白酶抑制劑MG132的處理結果表明,TCP2蛋白是通過26S蛋白酶體泛素化途徑降解。通過Luciferase assay測定翻譯抑制劑CHX處理下不同背景(包括WT、CRY1突變體cry1、cry1cry2雙突變
8、體和ZTL3突變體ztl3-1)中LUC-TCP2對藍光的響應,結果證明TCP2在藍光下的積累是受到多個藍光受體的影響,且mRNA的翻譯量會影響到蛋白的積累,這也側面地證明不同藍光受體都會通過影響TCP2的mRNA的表達量影響TCP2蛋白的積累。
對于TCP2 mRNA光影響因子的研究結果表明,TCP2的mRNA表達量通過光特異性依賴的方式受到許多光受體的影響。TCP2作為一個核定位的轉錄因子蛋白正調控HY5、HYH、CAB和
9、CHS的mRNA的表達。RBSS(Radom binding sites selection)結果表明TCP2的DNA結合位點為GGGGNCC。另外ChIP-qPCR結果表明TCP2蛋白能藍光特異性結合HY5和HYH的啟動子區(qū)域中的TCP2結合位點或相似性位點。以上結果表明TCP2作為轉錄因子作用于許多光受體的下游,其中就包括CRY1。
為了更好地研究CRY1與TCP2蛋白在植物內的相互作用,本研究設計了一套雙基因載體pDTs
10、(pDT1、pDT7和pDT7G),以期通過一次植物轉化實現(xiàn)兩個蛋白的同時表達。本研究構建多對基因至雙基因載體并轉入煙草或擬南芥中,通過定量、免疫印跡、熒光顯微鏡、免疫共沉淀、轉基因表型分析以及共表達效率分析試驗分析雙基因載體的實用性,得到如下結果:(1)多對基因通過雙基因表達載體在植物細胞內成功共表達;(2)pDT7G載體上cGR實現(xiàn)了其核質轉移功能;(3)共表達雙基因的生理生化功能未受影響;(4)雙基因載體能實現(xiàn)雙基因在植物細胞內的
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