人IC53基因cDNA轉(zhuǎn)基因小鼠的建立及其血管內(nèi)皮功能研究.pdf

1、IC53是從成人主動(dòng)脈cDNA文庫(kù)中克隆到的一個(gè)新基因。初步研究顯示，它可能對(duì)內(nèi)皮功能具有重要調(diào)節(jié)作用。IC53在多種正常組織和腫瘤細(xì)胞系中廣泛表達(dá)。原位雜交顯示，在心衰模型大鼠的心臟中，IC53主要在血管內(nèi)皮表達(dá)，并較正常對(duì)照升高。IC53超表達(dá)能促進(jìn)體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖并調(diào)控一系列與內(nèi)皮功能密切相關(guān)基因的表達(dá)。檢測(cè)IC53基因的自身抗體水平，發(fā)現(xiàn)其在心衰病人中升高。作為一個(gè)新基因，其在人體內(nèi)發(fā)揮何種作用以及作用的具體機(jī)制目前仍不很

2、清楚，在整體動(dòng)物水平尚無(wú)研究。 本研究采用內(nèi)皮特異表達(dá)的VE-cadherin啟動(dòng)子，連接人源的IC53 cDNA，獲得新的VE-IC53重組體，經(jīng)酶切反應(yīng)、測(cè)序鑒定確認(rèn)陽(yáng)性克隆。大量提取并純化VE-IC53重組體質(zhì)粒后，酶切分離目的DNA片段，經(jīng)CsCl梯度離心和緩沖液透析純化，選擇合適濃度的DNA用于顯微注射制備轉(zhuǎn)基因小鼠。經(jīng)Southern鑒定獲得了6株VE-IC53轉(zhuǎn)基因小鼠。RT-PCR產(chǎn)物測(cè)序證實(shí)轉(zhuǎn)基因在陽(yáng)性鼠體內(nèi)

3、可以表達(dá)。 檢測(cè)轉(zhuǎn)基因與野生型小鼠體內(nèi)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)水平的差異，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期蛋白p21在轉(zhuǎn)基因小鼠心臟和肺臟組織內(nèi)表達(dá)水平比野生型鼠明顯降低。p21蛋白能抑制大多數(shù)CDK的激酶活性和DNA的合成。p21蛋白增加可將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，促使細(xì)胞凋亡。反之，下調(diào)p21可以抑制凋亡，促進(jìn)增生。已有研究發(fā)現(xiàn)，p21蛋白適度下調(diào)，能在激活內(nèi)皮細(xì)胞增生的同時(shí)而不誘導(dǎo)凋亡，促進(jìn)新生血管形成。在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物組織中，p21蛋白被下調(diào)，但并

4、未完全抑制，與已有研究結(jié)果較為相似，提示IC53表達(dá)可能促進(jìn)血管生成。因此，雖然未能檢測(cè)到整體水平IC53轉(zhuǎn)基因動(dòng)物血管增生狀況的改變，但在分子水平IC53顯著抑制p21蛋白，有利于內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成。檢測(cè)CD31分子含量和抗PCNA的免疫組化染色未能發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮增生有明顯改變。 為了評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物血管內(nèi)皮舒張功能，首先測(cè)量動(dòng)物整體血壓并觀察血壓對(duì)藥物刺激的反應(yīng)性。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)基因動(dòng)物組的收縮壓和脈壓均較野生對(duì)照組升高，平均動(dòng)

5、脈壓和舒張壓未見(jiàn)明顯差異。這種現(xiàn)象與老年常見(jiàn)的單純收縮期高血壓較為類(lèi)似，可能是由于大動(dòng)脈血管彈性下降所致。給以舒張血管藥物后發(fā)現(xiàn)，兩組動(dòng)物血壓對(duì)硝普鈉的反應(yīng)性無(wú)明顯差異，但是，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物脈壓對(duì)乙酰膽堿的反應(yīng)程度較野生組明顯降低，提示轉(zhuǎn)基因動(dòng)物血管平滑肌的舒張功能正常但血管內(nèi)皮舒張功能降低。離體動(dòng)脈環(huán)張力實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)硝普鈉的反應(yīng)兩組動(dòng)物沒(méi)有差異，對(duì)乙酰膽堿的反應(yīng)轉(zhuǎn)基因組較對(duì)照組低，這同樣表明轉(zhuǎn)基因組動(dòng)物的大動(dòng)脈血管壁平滑肌的舒張功能沒(méi)

6、有異常，但內(nèi)皮功能下降。檢測(cè)ECE-1，ecNOS兩種基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)：與野生型相比，轉(zhuǎn)基因鼠肺臟中ecNOS基因的表達(dá)量降低；在心臟中ECE-1基因的表達(dá)量升高。 ecNOS和ECE-1分別是NO和ET-1的合成酶，它們調(diào)控著組織中的NO和ET-1的水平。而NO和ET-1在各種內(nèi)皮源性的血管張力調(diào)節(jié)因子中作用是最主要的。因此推測(cè)，轉(zhuǎn)基因IC53在小鼠體內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)，調(diào)節(jié)ECE-1和ecNOS的表達(dá)，升高心臟中ET-1水

7、平同時(shí)降低肺臟中NO含量，造成血管收縮，血管硬度增加而彈度降低。這可能是導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因動(dòng)物收縮壓和脈壓升高的原因。下調(diào)ecNOS使得血管合成NO的能力下降，因此在給以乙酰膽堿刺激時(shí)，轉(zhuǎn)基因鼠的反應(yīng)性較對(duì)照組明顯下降。 研究結(jié)果：1.將內(nèi)皮特異表達(dá)的VE-cadherin啟動(dòng)子與人源的IC53cDNA連接，獲得新的VE-IC53重組體，制備顯微注射DNA，并以之建立了6株VE-IC53轉(zhuǎn)基因小鼠。經(jīng)檢測(cè)證實(shí)轉(zhuǎn)基因在陽(yáng)性鼠體內(nèi)可以表達(dá)