人SIRT1基因cDNA內皮細胞特異轉基因鼠系的建立及其對動脈粥樣硬化的影響.pdf

1、動脈粥樣硬化是嚴重威脅人類健康的疾病，雖然其發(fā)病機制現(xiàn)在尚未闡明，但是大量研究證明內皮細胞功能失常是其發(fā)生的重要條件，在有明顯的病理變化之前內皮細胞功能失常已經存在。內皮細胞功能失常有諸多表現(xiàn)，其中內皮細胞特異的一氧化氮合酶(eNOS)基因表達下降是其重要標志，很多動脈粥樣硬化的危險因素都可以通過降低eNOS基因表達水平導致內皮細胞釋放一氧化氮(nitricoxide，NO)減少，使血管處于不正常的緊張狀態(tài)，促進動脈粥樣硬化的發(fā)生。許多

2、對心血管疾病有保護作用的因素和心血管疾病的有效干預措施也可通過上調eNOS表達來糾正內皮細胞功能失常，達到預防和治療動脈粥樣硬化及其并發(fā)癥的目的。因此，繼續(xù)尋找能夠調節(jié)內皮細胞eNOS表達水平的基因，并探索其在內皮細胞功能失常和動脈粥樣硬化發(fā)生中的作用，將有助于進一步闡明動脈粥樣硬化發(fā)生的機理。 SIRT1(Sirtuin1)是人類的Ⅲ類組蛋白去乙?；?，在各種物種之間呈現(xiàn)高度的保守性，甚至在原核生物中也有其同源基因，在人類的七

3、個Ⅲ類去乙?；赋蓡T中與酵母Sir2(silenceinformationregulator2)的同源性最高。近幾年的深入研究表明，人的SIRT1及其小鼠的同源基因Sir2α在胚胎發(fā)育、組織分化、代謝調節(jié)和抵抗不良環(huán)境因素損傷方面發(fā)揮重要作用。SIRT1是通過與多種重要的轉錄因子和轉錄輔助因子相互作用實現(xiàn)其功能的，這些轉錄因子包括MyoD、p300、PGC-1α、PPARγ、NF-κB、Ku70、p53以及FOXOs等。因為SIRT1在

4、抵抗不良環(huán)境因素的損傷方面發(fā)揮重要作用，而動脈粥樣硬化的發(fā)生過程與遺傳和環(huán)境危險因素對內皮細胞造成損傷密切相關，所以我們認為：在內皮細胞過表達SIRT1可以保護內皮細胞，抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生。為了驗證這個假說，我們進行了如下的研究。 首先，在研究內皮細胞的模型一人臍靜脈內皮細胞(huamnumbilicalveinendothelialcell.HUVEC)檢測到了SIRT1的表達；在氧化型低密度脂蛋白(oxidizedlow

5、densitylipoprotein.oxLDL)作用后HUVEC的SIRT1表達水平上升，提示SIRT1與oxLDL損傷HUVEC的過程有關。為了研究SIRT1在體內的功能，將SIRT1cDNA與VE-Cadherin啟動子連接，通過顯微注射受精卵的方法制備了內皮細胞特異表達SIRT1的轉基因小鼠，經過RT-PCR、Westernblot和免疫熒光三種方法證明SIRT1在小鼠的血管內皮細胞特異性高表達。為了檢測轉基因小鼠發(fā)生動脈粥樣硬

6、化程度的變化，將轉基因小鼠與動脈粥樣硬化的模型-apoE4-/-小鼠雜交，得到基因型為SIRT1+/apoE-/-的小鼠，以基因型為SIRT1-/apoE-/-的同窩同性別鼠作為對照，隨機分組喂高脂飲食誘發(fā)動脈粥樣硬化，持續(xù)10周和20周后，檢測主動脈粥樣斑塊的面積變化。結果顯示，在喂高脂飲食10周的雄性鼠中，陽性鼠動脈粥樣硬化斑塊的面積比對照鼠減少(動脈粥樣斑塊占主動脈總面積的平均值從19.3％減少到13.6％，p＜0.05)。而在喂

7、高脂飲食10周的雌性鼠中，陽性鼠與對照鼠相比動脈粥樣硬化的發(fā)生沒有明顯變化，與在研究其他基因時發(fā)生的情況相似，表明雌性鼠不適宜作為心血管疾病的動物模型，所以在本研究中分析機制時只針對雄性鼠。在喂20周高脂飲食的鼠中，陽性鼠與對照鼠動脈粥樣硬化的程度也沒有差異，說明SIRT1可能在動脈粥樣硬化發(fā)生的早期有保護作用，但這種保護作用可能不足以對抗不良因素長期作用(如高脂飲食20周)造成的損傷。分析動脈粥樣硬化發(fā)生減少的機制時發(fā)現(xiàn)，陽性鼠與對照

8、鼠相比體重、血脂和血糖水平這些系統(tǒng)性因素都沒有變化，因此推測內皮細胞本身的因素變化起到了抑制動脈粥樣硬化發(fā)生的作用，最有可能的是內皮細胞功能失常的改善。因為eNOS表達水平是內皮細胞功能的重要指標，eNOS水平下降是內皮細胞功能受損的標志，而eNOS水平上升是內皮細胞功能改善的指標，于是首先檢測eNOS水平的變化，RT-PCR和免疫熒光的結果都顯示在陽性鼠內皮細胞中eNOS水平上升。進一步用熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測SIRT1對eNOS啟