多拷貝水蛭素基因在畢赤酵母中的分泌型表達(dá).pdf

1、天然水蛭素是從醫(yī)用水蛭的唾液腺分泌的一種小分子活性多肽,是目前己知的自然界中最強(qiáng)的抗凝血因子,可有效防治血栓性疾病。由于天然水蛭素原料有限,產(chǎn)量低,成本高,限制了其臨床應(yīng)用,從而采用基因工程技術(shù)開發(fā)重組水蛭素,可克服以上不足。隨著基因工程在醫(yī)藥領(lǐng)域的深入應(yīng)用,重組水蛭素在細(xì)菌和酵母中的表達(dá)得到迅速發(fā)展。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是用于表達(dá)外源蛋白的最理想的表達(dá)系統(tǒng)之一,目前已有400多種外源蛋自在該表達(dá)系統(tǒng)中得以成功表達(dá)。
　　 本文旨在

2、構(gòu)建多拷貝分泌表達(dá)載體及水蛭素高表達(dá)酵母菌株,并獲得具有抗凝血酶活性的表達(dá)產(chǎn)物,為水蛭素的研究及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。我們利用全基因化學(xué)合成法合成歐洲醫(yī)蛭(Hirudo medicinalis)的水蛭素序列,克隆入畢赤酵母表達(dá)載體pAO815載體。畢赤酵母表達(dá)載體pAO815是Invitrogen公司開發(fā)的多拷貝胞內(nèi)表達(dá)載體,可以通過提高整合入酵母細(xì)胞的外源基因拷貝數(shù)來提高外源蛋白的表達(dá)產(chǎn)量,但由于該載體缺乏分泌信號(hào),其表達(dá)產(chǎn)物存在于酵母細(xì)

3、胞內(nèi),因而容易被降解,降低了表達(dá)產(chǎn)量的同時(shí)也不利于表達(dá)產(chǎn)物的分離和純化。為獲得一個(gè)表達(dá)量更高、產(chǎn)物更易于分離純化的表達(dá)系統(tǒng),我們對pAO815和外源基因進(jìn)行了巧妙的改造和構(gòu)建。實(shí)驗(yàn)中我們用到兩個(gè)載體pPIC9K和pAO815,這是目前應(yīng)用非常廣泛的酵母表達(dá)質(zhì)粒,前者屬分泌型質(zhì)粒,其多克隆位點(diǎn)上游含有酵母α因子信號(hào)肽編碼序列,表達(dá)產(chǎn)物可以分泌至胞外,極大簡化了蛋白純化方式；后者是胞內(nèi)表達(dá)型質(zhì)粒,提供構(gòu)建多拷貝質(zhì)粒的條件,使得表達(dá)載體在構(gòu)建

4、時(shí)即為多拷貝,大大提高了整合時(shí)產(chǎn)生多拷貝的幾率,從而提高表達(dá)物的產(chǎn)量。我們首先合成水蛭素序列,克隆入畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K中構(gòu)建pPIC9K-Hirudin重組質(zhì)粒,然后從pPIC9K-Hirudin中擴(kuò)增α-facor-Hirudin片段插入到載體pAO815中,使重組表達(dá)載體pAO815-α-facor-Hirudin具備分泌信號(hào)從而由胞內(nèi)表達(dá)變成分泌表達(dá)。最后通過酶切連接等方法體外構(gòu)建pAO815-(α-factor-Hir

5、udin)n多拷貝重組質(zhì)粒,從而得到了多拷貝分泌型表達(dá)載體。構(gòu)建的多拷貝重組質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,PCR篩選多拷貝表達(dá)菌株,經(jīng)過甲醇誘導(dǎo)表達(dá)并優(yōu)化表達(dá)條件,在30℃甲醇誘導(dǎo)120h的培養(yǎng)基中重組水蛭素的表達(dá)達(dá)到高峰。含尿素的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示培養(yǎng)基中含有單一的分子量為15kDa的蛋白條帶,雖與計(jì)算的重組水蛭素7kDa的分子量不相符,但經(jīng)分析和活性測定結(jié)果我們認(rèn)為該條帶為水蛭素的活性形式?；钚詼y定表明表達(dá)的水蛭素