人骨唾液酸蛋白非融合表達(dá)載體的構(gòu)建及在畢赤酵母中的表達(dá).pdf

1、骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein,BSP)是細(xì)胞外基質(zhì)中的一種高度糖基化、硫酸化和磷酸化的酸性糖蛋白,含有兩個(gè)保守的聚谷氨酸富集區(qū)和位于C-端的保守的RGD整合素結(jié)構(gòu)序列.BSP的組織分布具有局限性,僅在礦化的組織如骨、牙齒以及鈣化的軟骨與骨間的界面中存在,主要由成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞表達(dá)和分泌.BSP被認(rèn)為在礦化形成調(diào)節(jié)方面扮演重要的角色,此外近來(lái)又發(fā)出BSP與腫瘤骨轉(zhuǎn)移和血管生成方面相關(guān).因此,深入研究BSP的功能有助于

2、指導(dǎo)相關(guān)疾病的診斷與治療.目前獲得BSP的途徑有2個(gè),即直接從骨中提取和利用基因工程技術(shù)表達(dá)和制備重組BSP.該文報(bào)導(dǎo)了非融合的人BSP在畢赤酵母GS115中的表達(dá)研究.根據(jù)Genebank中人BSP基因的參考序列設(shè)計(jì)專一性引物,以已經(jīng)構(gòu)建的含人BSP全長(zhǎng)cDNA的pB-hbsp質(zhì)粒為模板,PCR擴(kuò)增得到人BSP基因,將人BSP基因序列經(jīng)Kpn I和Xho I雙酶切后定向克隆至pPICZαA載體,得到重組表達(dá)載體pPICZαA-hBSP

3、.在此基礎(chǔ)上構(gòu)建含有串聯(lián)的兩個(gè)表達(dá)盒重組表達(dá)載體pPICZαA-2xhBSP.通過(guò)電轉(zhuǎn)化的方法將pPICZαA-hbsp和pPICZαA-2xhbsp分別轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115中,篩選到轉(zhuǎn)化子后,用PCR鑒定表明上述兩種重組質(zhì)粒都分別整合到GS115基因組中,即表型為Mut<'+>.甲醇誘導(dǎo)GS115/pPICZαA-hbsp和GS115/pPICZαA-2xhbsp工程菌,收集含有分泌的rhBSP上清.上清經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在

4、分子量介于43-66KDa之間出現(xiàn)一較寬條帶,通過(guò)蛋白印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)此較寬的條帶確為rhBSP.GS115/pPICZαA-hbsp和GS115/pPICZαA-2xhbsp兩株工程細(xì)胞表達(dá)上清濃縮后的蛋白樣品總濃度分別為0.122g/L和0.132g/L.這兩種轉(zhuǎn)化子中rhBSP的表達(dá)量并無(wú)明顯差異,推測(cè)主要原因是由于這兩種轉(zhuǎn)化子的基因組中表達(dá)盒的數(shù)量可能相同.該文首次成功構(gòu)建串聯(lián)的非融合的重組人骨唾液酸蛋白基因表達(dá)盒并在畢赤酵母GS1