文昌魚(yú)(Branchiostoma belcheri)CFH基因的克隆、原核表達(dá)與免疫功能分析.pdf

1、補(bǔ)體系統(tǒng)(Complement system)是先天免疫的重要組成部分，通過(guò)經(jīng)典途徑(classical pathway)、凝集素途徑(lectin pathway)和替代途徑(alternative pathways)激活補(bǔ)體，進(jìn)而引起炎癥反應(yīng)，發(fā)揮溶菌作用，溶解免疫復(fù)合物，殺傷細(xì)胞和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等重要作用。補(bǔ)體因子H(Complement factor H，CFH)是替代途徑中一種重要的調(diào)節(jié)因子，最初被認(rèn)為是包含20個(gè)保守的補(bǔ)體蛋白

2、結(jié)構(gòu)域(conservedcomplement protein domains，CCP)的糖蛋白。每個(gè)補(bǔ)體蛋白結(jié)構(gòu)域，也稱(chēng)作一致重復(fù)短序列(short consensus repeats，SCRs)，都包含大概60個(gè)氨基酸，其中包括四個(gè)保守的半胱氨酸殘基，一個(gè)高度保守的色氨酸和一些相對(duì)保守的甘氨酸、脯氨酸和疏水性殘基。CFH蛋白可以通過(guò)結(jié)合C3b來(lái)抑制C3轉(zhuǎn)化酶的生成，同時(shí)也可以作為補(bǔ)體Ⅰ因子的輔因子加快C3b的降解，進(jìn)而使其失活。

3、r>　　文昌魚(yú)是脊索動(dòng)物的祖先，是研究無(wú)脊椎動(dòng)物過(guò)渡到脊椎動(dòng)物的模式動(dòng)物。形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)研究表明，文昌魚(yú)對(duì)闡明脊椎動(dòng)物進(jìn)化以及免疫系統(tǒng)起源起著重要作用。近年來(lái)，大量不同物種的基因組測(cè)序完成，特別是佛羅里達(dá)文昌魚(yú)(Branchiostoma floridae)全基因組測(cè)序的完成，以及比較免疫學(xué)的高速發(fā)展，使得人們?cè)絹?lái)越關(guān)注文昌魚(yú)免疫方面的研究，進(jìn)一步了解脊椎動(dòng)物進(jìn)化以及免疫系統(tǒng)起源方面的問(wèn)題。因此，本論文克隆得到了白氏文昌魚(yú)CFH基因

4、，并對(duì)其序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析;同時(shí)檢測(cè)了文昌魚(yú)CFH基因在不同組織中的表達(dá)情況;并對(duì)白氏文昌魚(yú)CFH基因的抗菌免疫進(jìn)行了初步研究。論文研究結(jié)果如下:
　　(1)克隆得到了白氏文昌魚(yú)CFH基因的全長(zhǎng)，命名為AmphiCFH。其cDNA序列全長(zhǎng)為1295bp，其中5'UTR為181bp，3'UTR為259bp，ORF長(zhǎng)為855bp。
　　(2)生物信息學(xué)分析表明，白氏文昌魚(yú)CFH蛋白(AmphiCFH)由284個(gè)氨基酸組成，

5、包含兩個(gè)保守的補(bǔ)體蛋白結(jié)構(gòu)域(CCP)和一個(gè)含24個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)N-糖基化位點(diǎn)。其預(yù)測(cè)分子量為31.12KDa，理論等電點(diǎn)為4.29。
　　(3)白氏文昌魚(yú)CFH基因的進(jìn)化地位位于無(wú)脊椎動(dòng)物與脊椎動(dòng)物之間，與經(jīng)典分類(lèi)法是一致的。
　　(4)通過(guò)原核表達(dá)實(shí)驗(yàn)，在大腸桿菌中表達(dá)出了一條特異蛋白條帶，并且其分子量大小與預(yù)計(jì)的白氏文昌魚(yú)CFH蛋白理論分子量大小相符。
　　(5)解剖白氏文昌魚(yú)成體，分離出肌肉、脊索

6、、肝盲囊、鰓和腸五個(gè)組織，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)AmphiCFH基因在五個(gè)組織中都有表達(dá)。表達(dá)量最高的是在脊索，此外肝盲囊和肌肉的表達(dá)量相對(duì)鰓和腸比較高。
　　(6)檢測(cè)LPS刺激后白氏文昌魚(yú)CFH基因的表達(dá)量在不同時(shí)間點(diǎn)(2h，4h，6h，8h，10h，12h，24h，48h)的變化，在8h和24h出現(xiàn)了顯著升高，并且在8h上升到最高。此變化初步證明了白氏文昌魚(yú)CFH基因參與先天免疫應(yīng)答，為進(jìn)一步研究CFH基因在文昌魚(yú)中的免疫機(jī)制提供了線索。