不同濃度臭氧治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠的療效及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種病因不明,累及周圍關(guān)節(jié)為主,多系統(tǒng)慢性炎癥性的自身免疫疾病。RA的發(fā)病在我國約為0.4％,在全世界約為0.5％～1.0％。其主要病變發(fā)生在關(guān)節(jié)滑膜,可累及關(guān)節(jié)軟骨、韌帶、肌腱及全身組織,引起關(guān)節(jié)腫痛,繼而軟骨破壞,關(guān)節(jié)間隙變窄。如不及早合理治療,3年內(nèi)關(guān)節(jié)破壞率達(dá)70％,最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和運動功能喪失。由于本病較高的發(fā)病率和致殘率,嚴(yán)重危害人們

2、的生活質(zhì)量。
　　 RA的病因仍未明確。RA的發(fā)病和環(huán)境、患者的免疫水平、遺傳因素、激素水平有很大的關(guān)系,同時肥胖人群、糖尿病患者、嗜煙人群的RA發(fā)病率也較高。研究發(fā)現(xiàn),在有親屬患RA的人群,其RA發(fā)病率較高,為10-30％。在RA的發(fā)病中,不同人種中發(fā)病率也有一定區(qū)別。男性RA發(fā)病率為:30-54/100000,女性為13—25/100000。歐洲和北美國家發(fā)病率為:0.5％～1％;南美、東南亞國家為:0.2%～0.3％；印第

3、安人群發(fā)病率最高,為:5.3％～6.8％。不同人種發(fā)病的不同,可能和HLA—DRB1、PAD14、PTPN22、FCRL3等基因的差異有關(guān)。因此,RA可能為易感個體被感染因子直接或間接激發(fā)所致,而T細(xì)胞、B細(xì)胞、成纖維樣細(xì)胞、關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞,以及包括腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1(interleukin-1,IL-1)、IL-6、IL-2、成纖維細(xì)胞生長因子(fibrobla

4、st growth factor,FGF)、血小板生長因子(platelet growth factor,PGF)、粒.巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)在內(nèi)的等多種細(xì)胞因子共同參與了RA的關(guān)節(jié)內(nèi)與全身的病變過程。
　　 RA發(fā)病機(jī)制尚未完全明確,因而臨床上還缺乏特異性治療措施,其治療更多是對癥治療,并一定程度上預(yù)防和控制關(guān)節(jié)破壞

5、以及功能的喪失,提高RA患者生活質(zhì)量。RA的常用治療方法包括藥物治療、自體造血干細(xì)胞移植、基因治療、免疫凈化、晚期的外科手術(shù)治療及其他的輔助治療。
　　 藥物治療包括非甾體抗炎藥、慢作用抗風(fēng)濕藥、糖皮質(zhì)激素、生物制劑等藥物。非甾體抗炎藥臨床應(yīng)用廣泛,可以有效減輕患者的疼痛癥狀,但長期使用易發(fā)生胃腸道癥狀與腎臟毒性損害,而且由于其抑制前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)的產(chǎn)生,可導(dǎo)致多種炎性細(xì)胞因子表達(dá)的上升

6、,促進(jìn)關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜成纖維樣細(xì)胞增殖,使遠(yuǎn)期關(guān)節(jié)損害更加嚴(yán)重。慢作用抗風(fēng)濕藥包括改善病情的抗風(fēng)濕藥和免疫抑制劑,需長期服藥。但這兩類藥物多有較嚴(yán)重的毒副作用,往往使患者治療期中不得不停藥,難以達(dá)到預(yù)期的療效。糖皮質(zhì)激素可采用全身用藥或局部關(guān)節(jié)注射的方式來治療RA,長期全身使用糖皮質(zhì)激素可產(chǎn)生明顯的副作用及形成依賴性,使用不當(dāng)則可能出現(xiàn)機(jī)會感染、無菌性骨壞死等嚴(yán)重的并發(fā)癥,有時這些副作用的危害甚至大于RA病變本身的危害；局部注射可以有效抑制患

7、者關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥反應(yīng),減輕其疼痛,但其不能頻繁注射,否則會對關(guān)節(jié)軟骨產(chǎn)生一定的破壞作用。生物制劑包括針對細(xì)胞黏附分子及受體的生物制劑、針對趨化因子及受體的生物制劑、針對細(xì)胞功能的生物制劑、針對細(xì)胞因子的生物制劑,常應(yīng)用于治療難治性RA。但是目前的生物制劑僅僅是針對某個靶點設(shè)計,適用范圍較為局限,其長期療效也有待觀察。隨著臨床應(yīng)用研究的深入,發(fā)現(xiàn)生物制劑的長期使用有可能導(dǎo)致嚴(yán)重的感染或活化隱性結(jié)核,而且其價格昂貴,也限制了生物制劑在臨床的應(yīng)用

8、。
　　 RA的外科治療主要包括微創(chuàng)或開放的方式切除病變滑膜和關(guān)節(jié)置換術(shù)。外科手術(shù)治療徹底,效果確切,但具有一定的風(fēng)險、費用較為昂貴,常應(yīng)用于其他治療方法無效的晚期RA。自體造血干細(xì)胞移植、基因治療、免疫凈化等治療方法已經(jīng)應(yīng)用于臨床,并取得一定效果,但其確切效果有待觀察。臭氧(Ozone,O3)是一種新興的治療方法,采用O3治療RA可在一定程度上克服上述治療的不足。
　　 O3對于關(guān)節(jié)病變的治療效果確切,但現(xiàn)有研究多集中

9、在應(yīng)用O3治療骨性關(guān)節(jié)炎方面。對于采用O3治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎方面,臨床有小規(guī)模的應(yīng)用,但對O3治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的效果無相關(guān)系統(tǒng)性研究,對O3治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的相關(guān)機(jī)制也未見報道。這給應(yīng)用O3治療RA帶來了一定的爭議,也限制了O3在治療RA方面的應(yīng)用。在本研究中,我們采用不同濃度(10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL)O3治療RA大鼠,觀察不同濃度O3治療前后RA大鼠大體情況、關(guān)節(jié)腫脹度,并通過組織

10、切片觀察O3對RA大鼠的療效和對RA大鼠滑膜組織的影響,評估不同濃度O3對于RA的治療效果,為臨床選用恰當(dāng)濃度的O3治療RA提供指導(dǎo)。
　　 目前人們普遍認(rèn)為,RA導(dǎo)致的功能障礙、軟骨損害、骨侵蝕、畸形,與關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞的凋亡障礙密切相關(guān)。凋亡是一種由基因控制的細(xì)胞程序性死亡方式,而細(xì)胞凋亡障礙被認(rèn)為是大多數(shù)腫瘤和自身免疫性疾病的一個重要病因。因此,要對RA進(jìn)行有效的治療,控制滑膜細(xì)胞的凋亡是非常關(guān)鍵的。RA的滑膜細(xì)胞凋亡過程,和

11、多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。在這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中,天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶(cysteine-eontaining aspartate-specific proteases,Caspase)家族起到非常關(guān)鍵的作用。
　　 Caspase-3介導(dǎo)細(xì)胞凋亡通路主要有三條:細(xì)胞內(nèi)通路、細(xì)胞外通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路,前兩條通路研究較多。在這三條通路中,TNF-α參與細(xì)胞外凋亡通路的介導(dǎo):TNF-α與腫瘤壞死因子受體-Ⅰ(tumour necro

12、sis factor receptor-Ⅰ,TNFRⅠ)結(jié)合后,三聚體化的TNFRⅠ通過胞內(nèi)死亡域,與腫瘤壞死因子受體相關(guān)死亡域和胞質(zhì)中相關(guān)死亡域相結(jié)合,向下傳導(dǎo)凋亡信號,活化上游的caspase-8蛋白,然后激活下游的caspase-3蛋白,引起細(xì)胞內(nèi)DNA的裂解,從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
　　 B-細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因家族蛋白(B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)主要在細(xì)胞凋亡的線粒體途徑即凋亡的

13、細(xì)胞內(nèi)通路起作用。Bcl-2和B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因關(guān)聯(lián)x蛋白(B cell lymphoma/lewkmia-2 associated protein x,Bax)分別是Bcl-2家族中最有代表性的抑凋亡和促凋亡分子。在正常生理狀態(tài)下,細(xì)胞內(nèi)的Bcl-2通過BH3結(jié)構(gòu)域,與同家族的促凋亡分子形成異源二聚體,從而維持促凋亡蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位分布。在細(xì)胞凋亡過程中,Bcl-2在凋亡相關(guān)因子激活下,易位到細(xì)胞內(nèi)的線粒體膜上,破壞細(xì)胞線

14、粒體的完整性,釋放線粒體內(nèi)的促凋亡因子,經(jīng)過細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活化上游的Caspase蛋白,并產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)激活下游的Caspase蛋白,使凋亡信號轉(zhuǎn)到途徑逐步放大,最終導(dǎo)致凋亡發(fā)生。Bax是Bcl-2活性的主要調(diào)控因子,也是Bcl-2家族中研究最廣泛的促凋亡蛋白。Bax主要通過與Bcl-2形成異源二聚體來調(diào)控細(xì)胞的凋亡過程。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2增多時,大量Bcl-2與Bax結(jié)合,形成的異源二聚體,減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生；當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Bax含量較多時,B

15、ax除了與Bcl-2形成異源二聚體外,大量的Bax自身形成的同源二聚體,使細(xì)胞凋亡現(xiàn)象增強(qiáng)。凋亡信號能激活Bax,使Bax從細(xì)胞漿移位到線粒體膜上。Bax在移位到線粒體膜上后,很快形成同源二聚體,促進(jìn)凋亡,而Bcl-2則在Bax誘發(fā)凋亡過程中對其功能進(jìn)行限制。因此,Bcl-2、Bax的含量及Bcl-2/Bax比值對決定細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡狀態(tài)有重要意義。
　　 本課采用不同濃度O3治療膠原誘導(dǎo)的RA大鼠,觀察不同濃度對RA大鼠滑膜炎

16、和滑膜增生的影響,并通過不同濃度O3對RA大鼠滑膜凋亡率以及Caspase-3含量和表達(dá)的影響,從O3影響RA大鼠滑膜細(xì)胞凋亡方面解釋O3治療RA的機(jī)制；同時觀察不同濃度O3對RA大鼠滑膜細(xì)胞細(xì)胞外與細(xì)胞內(nèi)凋亡通路的影響,進(jìn)一步闡述O3對RA的治療機(jī)制。
　　 研究目的：
　　 1.評估O3對于RA大鼠滑膜炎的和滑膜增生影響,為臨床選用恰當(dāng)濃度的O3治療RA提供指導(dǎo)。
　　 2.研究不同濃度O3對RA大鼠滑膜凋亡

17、率以及Caspase-3含量和表達(dá)的影響,探討O3治療RA的機(jī)制。
　　 3.研究不同濃度O3對RA大鼠血清和滑膜TNF-α、TNFRⅠ、TNFRⅡ的含量的影響,從細(xì)胞外凋亡途徑闡述O3對RA的治療機(jī)制。
　　 4.研究不同濃度O3對RA大鼠滑膜Bcl-2、Bax表達(dá)的影響,從細(xì)胞內(nèi)凋亡途徑闡述O3對RA的治療機(jī)制。
　　 研究方法：
　　 1.大鼠RA模型的建立
　　 健康雄性Wistar大鼠4

18、8只,采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為正常對照(CON組,n=6)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎組(RA組,n=6)、純氧注射組(O2組,n=6)和O3治療組(O3組,n=30)。O3組根據(jù)關(guān)節(jié)腔注射O3的不同濃度(μg/mL)分為5個亞組:①O3-10組、②O3-20組、③O3-30組、④O3-40組、⑤O3-50組,每亞組n=6。取一定量的牛Ⅱ型膠原蛋白溶于0.1M冰醋酸溶液中,配制質(zhì)量濃度為2 mg/mL溶液,置4℃冰箱中過夜。冰浴下配置濃度為1

19、mg/mL的膠原溶液,抽取1mL于大鼠背部脊柱兩側(cè)及尾部皮下分點注射,1周后注射0.5mL加強(qiáng)免疫一次,建立大鼠RA模型。CON組不作任何特殊處理。
　　 2.O3治療
　　 造模成功后,O2組大鼠注射純氧1mL,1周注射一次,共注射3周；O3組的5個亞組根據(jù)分組情況分別注射濃度為10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL的O3各1mL,1周注射一次,共注射3周。CON組和RA組不予以

20、任何治療。
　　 3.取材
　　 治療結(jié)束后1周,戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉下,戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉下,用75％酒精消毒大鼠后肢和尾部,沿膝關(guān)節(jié)正中縱行切開皮膚,暴露膝關(guān)節(jié),完整剝離滑膜組織。所有動物在O2組和O3組大鼠在最后一次關(guān)節(jié)腔注射1周后處死,進(jìn)行關(guān)節(jié)滑膜的取材,4％多聚甲醛固定過夜。同時,斷尾取血,離心機(jī)離心,取上清液。
　　 4.不同濃度O3對大鼠關(guān)節(jié)腫脹情況的影響
　　 從造模開始至動物處死,

21、每周記錄1次。
　　 5.不同濃度O3對大鼠足爪厚度的影響
　　 用電子游標(biāo)卡尺測量小鼠雙足后肢足掌厚度,從造模開始每周測量一次,直至處死。分別測量3次,取平均值。
　　 6.不同濃度O3對RA大鼠關(guān)節(jié)滑膜切片的影響
　　 取大鼠關(guān)節(jié)滑膜標(biāo)本,常規(guī)方法脫水、透明、浸蠟包埋成石蠟塊,應(yīng)用石蠟切片機(jī),制成4Bm的石蠟切片。HE染色觀察滑膜組織增生、炎性細(xì)胞浸潤、結(jié)締組織增生、血管翳產(chǎn)生的情況。不同濃度03對大

22、鼠關(guān)節(jié)腫脹情況的影響
　　 7.不同濃度O3對RA大鼠關(guān)節(jié)滑膜凋亡指數(shù)的影響
　　 取膝關(guān)節(jié)滑膜組織石蠟切片,行轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的三磷酸脫氧鳥苷-生物素刻痕末端標(biāo)記(transferase-mediated deoxyuridine triphosphate-biotin nick end labeling,Tunel)法染色后,沿滑膜組織帶計算×400視野中細(xì)胞的凋亡數(shù),計數(shù)5個視野,記錄每個視野平均凋亡數(shù),取其平均值。正常

23、滑膜細(xì)胞為藍(lán)紫色,凋亡滑膜細(xì)胞為棕色。細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptotic index,AD計算方法:AI=(凋亡細(xì)胞數(shù)÷滑膜細(xì)胞總數(shù))×100％。
　　 8.Caspase-3分光光度法檢測
　　 取滑膜上清液,采用分光光度計于λ=405nm測定其吸光值。通過計算OD來確定Caspase-3含量。
　　 9.Caspase-3的West-blotting檢測
　　 滑膜取材后,抽提滑膜蛋白,上樣10μg加入

24、到20μl2×十二羥硫酸鈉凝膠加樣緩沖液中,沸水中煮沸8分鐘使蛋白變性,10000rpm離心5分鐘。上樣后以電壓100伏轉(zhuǎn)膜1小時,10％脫脂奶粉的封閉液中封閉2小時。加入一抗(1:500)、二抗(1:1000)各反應(yīng)1小時,后續(xù)工作按EEL發(fā)光試劑盒說明書完成。采用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(37 kD)做為內(nèi)參。
　　 10.大鼠血清與滑膜TNF-α、TNFRⅠ、TNFRⅡ含量的檢測
　　 取滑膜上清液與血漿,行血清TN

25、F-α、TNFRⅠ、TNFRⅡ含量的酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)。
　　 11.不同濃度O3對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠Bcl-2、Bax表達(dá)的影響
　　 大鼠滑膜組織切片于60℃恒溫箱烘烤60min進(jìn)行烘片,二甲苯脫蠟,乙醇梯度水化,3％H2O2-甲醇溶液滅活酶,分別加入100ul一抗(Bcl-2和Bax稀釋度均為1:100)和熒光標(biāo)記二抗,封片,熒光顯微鏡

26、觀察拍照。每個關(guān)節(jié)觀察2張切片,陽性細(xì)胞計數(shù)取兩張切片的均值。每張切片觀察×400下5個視野。
　　 12.數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
　　 所得數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件行統(tǒng)計學(xué)處理,對大鼠足爪厚度的比較采用GeneralLinear Model中的repeated measures進(jìn)行分析,檢驗水準(zhǔn)為α=0.05,P≤0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義或有顯著性差異。其余測量數(shù)據(jù)均采用Compare Means中的one-wayanov

27、a進(jìn)行分析,檢驗水準(zhǔn)為α=0.05,p≤0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義或有顯著性差異。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.不同濃度O3對大鼠關(guān)節(jié)腫脹情況的影響
　　 造模7d后,大鼠出現(xiàn)滑膜炎癥狀,雙足各個關(guān)節(jié)及足墊出現(xiàn)紅腫,造模14d關(guān)節(jié)紅腫明顯。造模后21d大鼠關(guān)節(jié)腫脹達(dá)到高峰。RA組、O2組、O3-10組、O3-20組大鼠28d后關(guān)節(jié)腫脹逐漸減輕,處死前仍存在關(guān)節(jié)紅腫現(xiàn)象。
　　 第一次、第二次O3注射后一

28、周,O3-30組、O3-40組大鼠紅腫現(xiàn)象均較前次顯著減輕。第三次O3注射后一周,O3-30組、O3-40組大鼠已無紅腫現(xiàn)象。第一次O3注射后一周,O3-50組大鼠紅腫現(xiàn)象較注射前更為顯著。第二次O3注射后一周及處死前,O3-50組大鼠紅腫現(xiàn)象紅腫仍較明顯,但較第一次有所減輕。
　　 2.不同濃度O3對大鼠足爪厚度的影響
　　 實驗前各組大鼠之間足爪厚度無顯著差異(P>0.05)。除CON組大鼠外,各組大鼠足爪厚度7 d

29、開始逐漸增高,造模后21d關(guān)節(jié)厚度最大。與造模后21d相比,造模后28d O3-30組、O3-40組大鼠足爪厚度減小(P<0.01),兩組組問比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。造模后35d,RA組、O2組O3-10組、O3-20組、O3-40組、O3-50組大鼠足爪厚度較CON組增大,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),O3-30組與CON組及RA組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。造模后42d,O3-40組大鼠足爪厚度較造模后35d減小,差異

30、有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與CON組相比,RA組、O2組、O3-10組、O3-20組、O3-30組大鼠足爪厚度增大,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。O3-50組大鼠足爪厚度較CON組增大,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
　　 3.不同濃度O3對RA大鼠關(guān)節(jié)滑膜切片的影響
　　 CON組:關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)正常,滑膜組織無充血水腫,滑膜細(xì)胞無增生現(xiàn)象,無血管翳形成；RA組、O2組:可見明顯的滑膜細(xì)胞和結(jié)締組織增生,排列紊亂

31、,炎性細(xì)胞浸潤明顯,滑膜組織內(nèi)有血管翳形成；O3-10組、O3-20組:滑膜細(xì)胞增生略有減輕,滑膜組織充血水腫減輕,血管增生和浸潤炎細(xì)胞數(shù)量減少,血管翳形成減少；O3-30組、O3-40組:滑膜細(xì)胞增生不明顯,滑膜組織充血水腫明顯減輕,血管增生和浸潤炎細(xì)胞數(shù)量減少,血管翳形成顯著減少；O3-50組:滑膜組織較CON組減少,排列紊亂,結(jié)締組織增生,炎細(xì)胞浸潤明顯。
　　 4.不同濃度O3對RA大鼠關(guān)節(jié)滑膜凋亡指數(shù)的影響
　　

32、 CON組滑膜存在散在凋亡。與CON組相比,RA組、O2組的正常和凋亡滑膜細(xì)胞增多,凋亡率下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。與模型組相比,各O3治療組凋亡率上升。其中,O3-10組、O3-20組滑膜細(xì)胞凋亡率與RA組相比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；O3-30組、O3-40組、O3-50組滑膜細(xì)胞凋亡率與RA組相比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 5.不同濃度O3對RA大鼠關(guān)節(jié)滑膜Caspase-3含

33、量的影響
　　 與CON組相比較,RA組、O2組O3-10組大鼠滑膜中Caspase-3含量降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；三組組間相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與CON組相比較,O3-30組、O3-40組Caspase-3含量升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。二組組間相比,O3-40組Caspase-3含量高于O3-30組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。O3-20組、O3-50組大鼠滑膜中Caspa

34、se-3含量與CON組相比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　 6.不同濃度O3對RA大鼠關(guān)節(jié)滑膜Caspase-3蛋白表達(dá)的影響
　　 與CON組相比較,RA組、O2組、O3-10組O3-50組大鼠滑膜Caspase-3蛋白表達(dá)下降,差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與CON組相比較,O3-20組大鼠滑膜Caspase-3蛋白表達(dá)下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與CON組相比,O3-30組大鼠滑

35、膜Caspase-3蛋白表達(dá)升高,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與CON組相比較,O3-40組大鼠滑膜Caspase-3蛋白表達(dá)升高,差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
　　 7.不同濃度O3對RA大鼠關(guān)節(jié)滑膜Bcl-2、Bax表達(dá)的影響
　　 各組大鼠滑膜組織均可見Bcl-2和Bax陽性表達(dá)細(xì)胞,其中CON組表達(dá)最弱,RA組表達(dá)最強(qiáng)。與CON組相比較,RA組、O2組、O3-10組大鼠滑膜中Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)

36、增多,Bax陽性細(xì)胞數(shù)減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；三組組間相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與RA組相比較,O3-20組、O3-50大鼠滑膜中Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)減少,Bax陽性細(xì)胞數(shù)增多,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；兩組組間相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與RA組相比較,O3-30組、O3-40組大鼠滑膜內(nèi)Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)減少,Bax陽性細(xì)胞數(shù)增多,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。二組組間相比,差

37、異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.采用關(guān)節(jié)內(nèi)注射濃度為40μg/mL的O3治療RA,可以明顯減輕滑膜的炎性細(xì)胞的浸潤,減少結(jié)締組織和血管翳的形成,緩解關(guān)節(jié)腫脹,具有較好的治療效果。
　　 2.O3治療RA的機(jī)制與其增加RA大鼠滑膜細(xì)胞凋亡,上調(diào)Caspase-3蛋白表達(dá)有關(guān)。
　　 3.O3可以降低滑膜內(nèi)TNF-α、TNFRⅡ的活性,上調(diào)TNFRⅠ的表達(dá),以關(guān)節(jié)內(nèi)注射濃度為40μg