超聲微泡聯(lián)合萬(wàn)古霉素對(duì)表皮葡萄球菌生物膜的干預(yù)作用及機(jī)制研究.pdf_第1頁(yè)
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1、第一部分臨床分離表皮葡萄球菌的產(chǎn)生物膜特性及序列分型
  [目的]表皮葡萄球菌是醫(yī)院感染尤其是材料相關(guān)性感染的主要致病菌。本研究選取臨床分離的表皮葡萄球菌菌株,分析生物膜(biofilm,BF)陽(yáng)性菌株和BF陰性菌株在表型和基因型上的差別,以說(shuō)明BF對(duì)表皮葡萄球菌致病的重要性。
  [方法]收集德國(guó)維爾茨堡大學(xué)附屬兒童醫(yī)院2013年10月至2014年1月送檢靜脈導(dǎo)管及血標(biāo)本中分離出的5株表皮葡萄球菌菌株。VITEK(@)2

2、Compact藥敏分析系統(tǒng)分析菌株的耐藥譜、剛果紅定性實(shí)驗(yàn)和結(jié)晶紫半定量粘附實(shí)驗(yàn)分析菌株的產(chǎn)BF能力、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)菌株的BF相關(guān)基因icaA及IS256的表達(dá)。采用多位點(diǎn)序列分型技術(shù)對(duì)菌株進(jìn)行病原學(xué)分型,并將獲得的序列型(sequence type,ST)與表皮葡萄球菌數(shù)據(jù)庫(kù)的eBURST遺傳進(jìn)化圖進(jìn)行對(duì)照。
  [結(jié)果]BF陽(yáng)性菌株與陰性菌株在表型及基因型上存在明顯差別。同BF陰性菌株相比,BF陽(yáng)性菌株耐藥譜更廣、對(duì)材料表

3、面的粘附力更強(qiáng)。病原學(xué)分型顯示BF陽(yáng)性菌株與BF陰性菌株分別屬于ST2和ST10,前者基因icaA和IS256的表達(dá)水平高于后者。eBURST遺傳進(jìn)化圖顯示ST2是全球多地傳播的表皮葡萄球菌的源ST。
  [結(jié)論]BF陽(yáng)性菌株因其特殊表型和遺傳變異性,能有效抵御來(lái)自醫(yī)院環(huán)境的不良應(yīng)激因素,成為醫(yī)院感染的主要致病菌。
  第二部分超聲微泡干預(yù)表皮葡萄球菌BF的體外實(shí)驗(yàn)裝置的建立
  [目的]建立一種超聲微泡干預(yù)表皮葡萄球

4、菌BF的體外實(shí)驗(yàn)裝置。
  [方法]采用表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC35984(RP62A),稀釋平板計(jì)數(shù)法繪制菌液濃度與光密度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將10ml接種菌液注入OpticellTM1100細(xì)胞培養(yǎng)裝置中建立表皮葡萄球菌BF體外模型,快速銀染法及掃描電鏡鑒定BF的形成。采用超聲振蕩法制備超聲微泡,微泡注入OpticellTM內(nèi)腔后將OpticellTM倒置于超聲水箱中,超聲波經(jīng)脫氣水、聚苯乙烯薄膜及培養(yǎng)基作用于緊密接觸的微泡層和

5、BF層。
  [結(jié)果]表皮葡萄球菌菌液濃度與光密度值呈線性相關(guān),接種菌液濃度約為每毫升2×108集落形成單位(colony forming unit,CFU)。超聲振蕩法制備的脂質(zhì)微泡濃度約1.2×109/ml,直徑為4-6μm。OpticellTM裝置可用于體外培養(yǎng)細(xì)菌BF,以O(shè)pticellTM為基礎(chǔ)組建的超聲水箱系統(tǒng)減少了超聲波的衰減,同時(shí)BF層和微泡層緊密接觸、使實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性顯著提高。
  [結(jié)論]本部分實(shí)驗(yàn)利用傳統(tǒng)

6、的細(xì)胞培養(yǎng)裝置OpticellTM成功的建立了一種有效的用超聲微泡干預(yù)表皮葡萄球菌BF的體外實(shí)驗(yàn)裝置。
  第三部分超聲微泡聯(lián)合萬(wàn)古霉素對(duì)表皮葡萄球菌BF的協(xié)同殺菌作用
  [目的]以BF為研究對(duì)象進(jìn)行抗生素藥敏試驗(yàn),探討超聲微泡與萬(wàn)古霉素之間是否存在協(xié)同殺菌作用。
  [方法]在OpticellTM裝置中培養(yǎng)表皮葡萄球菌BF,采用稀釋平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)空白對(duì)照組、單獨(dú)超聲組、單獨(dú)微泡組、超聲+低濃度微泡(1%,v/v)組

7、及超聲+高濃度微泡(4%,v/v)組中BF活菌數(shù)量的差異。微量肉湯稀釋法測(cè)定萬(wàn)古霉素對(duì)浮游細(xì)菌的最小抑菌濃度(minimalinhibitory concentration,MIC),并以細(xì)菌BF為研究對(duì)象測(cè)定萬(wàn)古霉素在上述不同干預(yù)方式下的最小生物膜抑制濃度(biofilm inhibitoryconcentration, BIC)。
  [結(jié)果]空白對(duì)照組BF中的活菌數(shù)為8.028±0.043 log10 CFU/cm2,在無(wú)抗

8、生素作用時(shí)超聲+低濃度微泡對(duì)BF細(xì)菌無(wú)顯著殺滅作用(8.041±0.0491og10 CFU/cm2),而超聲+高濃度微泡能減少BF中的活菌數(shù)量至7.949±0.012 log10 CFU/cm2(P<0.05)。萬(wàn)古霉素對(duì)浮游細(xì)菌的MIC為2μg/ml,對(duì)細(xì)菌BF的BIC為512μg/ml,單純超聲可將BIC降至128μg/ml,而超聲+微泡能進(jìn)一步降低BIC至16μg/ml,超聲微泡對(duì)萬(wàn)古霉素的協(xié)同殺菌效應(yīng)與微泡濃度呈正相關(guān)。

9、>  [結(jié)論]BF細(xì)菌對(duì)萬(wàn)古霉素的抵抗性較浮游細(xì)菌高數(shù)百倍,超聲介導(dǎo)下的微泡能協(xié)同萬(wàn)古霉素發(fā)揮殺菌作用。
  第四部分超聲微泡聯(lián)合萬(wàn)古霉素對(duì)表皮葡萄球菌BF體外干預(yù)作用的定性與定量分析
  [目的]探討超聲微泡聯(lián)合萬(wàn)古霉素對(duì)體外表皮葡萄球菌BF的活菌數(shù)量、結(jié)構(gòu)和形態(tài)的影響。
  [方法]OpticellTM裝置培養(yǎng)表皮葡萄球菌BF,設(shè)空白對(duì)照組、單獨(dú)微泡組、單獨(dú)超聲組、超聲+微泡組、單獨(dú)萬(wàn)古霉素組、微泡+萬(wàn)古霉素組、超

10、聲+萬(wàn)古霉素組及超聲+微泡+萬(wàn)古霉素組,微泡濃度包括低濃度(1%,v/v)和高濃度(4%,v/v)兩個(gè)參數(shù)。超聲工作頻率為300KHz、能量為0.5W/cm2、脈沖周期為1∶1、工作時(shí)間為5min。萬(wàn)古霉素的干預(yù)濃度為32μg/ml,干預(yù)時(shí)間為24小時(shí)。分別采用平板計(jì)數(shù)法、掃描電鏡(scanning electron microscopy, SEM)及激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscopy

11、, CLSM)分析各干預(yù)組中BF的活菌數(shù)量及形態(tài)結(jié)構(gòu)。
  [結(jié)果]在無(wú)超聲介導(dǎo)時(shí)脂質(zhì)微泡本身無(wú)殺菌作用。與空白對(duì)照組比較,超聲+萬(wàn)古霉素能顯著減少BF中的活菌比例至38.98%±3.95%(P<0.05),加入微泡后該殺菌效應(yīng)進(jìn)一步增強(qiáng),且高濃度微泡的殺菌作用較低濃度微泡更為顯著(6.10%±1.31% vs22.29%±2.99%, P<0.05)。在所有干預(yù)方式中,超聲+微泡+萬(wàn)古霉素對(duì)BF結(jié)構(gòu)的破壞作用最大,能顯著減少BF

12、的厚度、增大BF孔徑并使BF的三維結(jié)構(gòu)趨于簡(jiǎn)單。掃描電鏡觀察到超聲+微泡干預(yù)后BF中部分細(xì)菌被破壞,可見(jiàn)團(tuán)塊狀細(xì)菌殘骸,經(jīng)高濃度超聲微泡作用后的BF中細(xì)菌殘骸較低濃度超聲微泡組增多。
  [結(jié)論]超聲介導(dǎo)下的微泡能破壞表皮葡萄球菌BF的形態(tài)和結(jié)構(gòu),進(jìn)而增強(qiáng)萬(wàn)古霉素對(duì)BF的殺菌作用。
  第五部分超聲微泡干預(yù)表皮葡萄球菌BF的物理及生化機(jī)制
  [目的]從物理作用及生化作用兩個(gè)方面對(duì)超聲微泡產(chǎn)生聲生物效應(yīng)的機(jī)制進(jìn)行探討。

13、
  [方法]OpticellTM裝置培養(yǎng)表皮葡萄球菌BF,采用激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscopy, CLSM)定性觀察經(jīng)超聲+微泡干預(yù)后BF細(xì)菌對(duì)大分子熒光染料的攝取情況,以間接證實(shí)“聲致穿孔效應(yīng)”。超聲或超聲+微泡干預(yù)BF后,紙片擴(kuò)散法測(cè)定12h內(nèi)BF胞外基質(zhì)對(duì)萬(wàn)古霉素分子的通透性的變化趨勢(shì)。設(shè)空白對(duì)照組、單獨(dú)超聲組、超聲+低濃度微泡組(1%,v/v)、超聲+高濃度微泡組(4

14、%,v/v)、單獨(dú)萬(wàn)古霉素組、超聲+萬(wàn)古霉素組、超聲+低濃度微泡+萬(wàn)古霉素組及超聲+高濃度微泡+萬(wàn)古霉素組,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定表皮葡萄球菌BF調(diào)控系統(tǒng)的重要基因agrB、RNAⅢ和icaA在不同干預(yù)組中的mRNA表達(dá)情況。
  [結(jié)果]空白對(duì)照組中大分子熒光染料不易通過(guò)細(xì)菌胞膜,CLSM下僅見(jiàn)稀疏點(diǎn)狀熒光。經(jīng)超聲+微泡干預(yù)后胞膜通透性增大使得較多熒光染料分子進(jìn)入胞內(nèi),且染料的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)與微泡濃度相關(guān)。BF為影響萬(wàn)古霉素分子

15、通過(guò)聚苯乙烯薄膜的限速步驟,有BF的聚苯乙烯膜與空白聚苯乙烯膜在第12h末通過(guò)的抗生素量分別為負(fù)荷量的41.47%±1.6%和64.57%±4.19%(P<0.05),予以超聲+微泡干預(yù)后通過(guò)BF的抗生素量在所有時(shí)間點(diǎn)均顯著增加,且該促滲效應(yīng)較單獨(dú)超聲干預(yù)更強(qiáng)。單獨(dú)萬(wàn)古霉素干預(yù)后agrB和RNAⅢ兩個(gè)基因的表達(dá)量分別為空白對(duì)照組的1.12倍及1.25倍(P<0.05),同時(shí)icaA基因的表達(dá)量下降至空白對(duì)照組的0.87(P<0.05)。

16、與空白對(duì)照組比較,超聲+高濃度微泡+萬(wàn)古霉素使agrB和RNAⅢ兩個(gè)基因的表達(dá)水平分別增加至空白對(duì)照組的1.40倍及1.35倍(P<0.05),同時(shí)icaA基因的表達(dá)量下降至空白對(duì)照組的0.67(P<0.05)。超聲+微泡+萬(wàn)古霉素組較超聲+萬(wàn)古霉素組對(duì)基因agrB和RNAⅢ的上調(diào)作用以及對(duì)icaA的抑制作用更加顯著(P<0.05)。
  [結(jié)論]超聲微泡可增加細(xì)菌胞膜及BF胞外基質(zhì)對(duì)萬(wàn)古霉素分子的通透性,同時(shí)還可干擾BF的信號(hào)調(diào)

17、控系統(tǒng),使BF相關(guān)基因agrB和RNAⅢ的表達(dá)上調(diào)、icaA的表達(dá)下調(diào)。在超聲微泡干預(yù)細(xì)菌BF的過(guò)程中物理機(jī)制與生化機(jī)制共同參與,協(xié)同萬(wàn)古霉素發(fā)揮殺菌作用。
  第六部分超聲微泡聯(lián)合萬(wàn)古霉素對(duì)表皮葡萄球菌BF的體內(nèi)干預(yù)作用
  [目的]建立動(dòng)物皮下內(nèi)置材料表面BF相關(guān)性感染的體內(nèi)模型,探討超聲微泡聯(lián)合萬(wàn)古霉素對(duì)體內(nèi)表皮葡萄球菌BF的干預(yù)作用。
  [方法]將長(zhǎng)有表皮葡萄球菌BF的聚四氟乙烯導(dǎo)管植入實(shí)驗(yàn)兔脊柱兩側(cè)的皮下隧

18、道內(nèi),采用自身對(duì)照法設(shè)置空白對(duì)照組、單獨(dú)超聲組、超聲+微泡組、萬(wàn)古霉素組、超聲+萬(wàn)古霉素組及超聲+微泡+萬(wàn)古霉素組。干預(yù)結(jié)束后處死動(dòng)物,將皮下植入材料取出,采用掃描電鏡(scanning electron microscopy, SEM)觀察不同干預(yù)組中導(dǎo)管表面的BF、稀釋平板法測(cè)定BF中的活菌數(shù),并對(duì)植入材料周圍的皮下組織行病理組織學(xué)檢查。
  [結(jié)果]導(dǎo)管在植入動(dòng)物皮下前菌荷量為7.284±0.032 log10CFU/cat

19、heter。空白對(duì)照組、單獨(dú)超聲組、超聲+微泡組、萬(wàn)古霉素組、超聲+萬(wàn)古霉素組及超聲+微泡+萬(wàn)古霉素組中BF活菌數(shù)分別為6.436±0.033 log10 CFU/catheter、6.464±0.066 log10 CFU/catheter、6.440±0.048 log10 CFU/catheter、5.395±0.032 log10 CFU/catheter、5.152±0.035 log10 CFU/catheter及3.493

20、±0.021 log10 CFU/catheter,同超聲+萬(wàn)古霉素組相比,超聲+微泡+萬(wàn)古霉素的殺菌作用更為顯著(P<0.05)。SEM見(jiàn)萬(wàn)古霉素干預(yù)后BF結(jié)構(gòu)變得疏松、細(xì)菌數(shù)量減少,單獨(dú)超聲+萬(wàn)古霉素可破壞BF的三維結(jié)構(gòu),僅余不規(guī)則分布的細(xì)菌團(tuán)塊,超聲+微泡+抗生素組中僅見(jiàn)散在分布的數(shù)個(gè)細(xì)菌。病理組織學(xué)檢查提示超聲微泡聯(lián)合萬(wàn)古霉素作用后可使動(dòng)物皮下內(nèi)置材料周圍的炎癥反應(yīng)減輕,且未對(duì)正常皮下組織造成明顯損傷。
  [結(jié)論]本部分

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