鎘對小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞毒性作用的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：以體外培養(yǎng)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞系 TM3細(xì)胞為模型，研究鎘對 TM3細(xì)胞的毒性作用，進(jìn)而探討鎘對TM3細(xì)胞毒作用的分子機(jī)制。
　　方法：(1)給予不同濃度的CdCl2(0μM,5μM,10μM,20μM,40μM)處理TM3細(xì)胞，分別孵育不同時間(4h,8h,12h,16h,24h)，采用CCK-8法檢測各組細(xì)胞活力。
　　(2)給予20μM CdCl2處理TM3細(xì)胞不同的時間(4h,8h)后收集細(xì)胞及上清液，采用ELIS

2、A法測定細(xì)胞上清液中睪酮的水平，采用western blot和RT-PCR法檢測睪酮合成通路關(guān)鍵酶蛋白和mRNA的表達(dá)水平。
　　(3)給予20μM CdCl2處理TM3細(xì)胞不同的時間(4h,8h)后收集細(xì)胞，采用western blot和RT-PCR法檢測氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白和mRNA的表達(dá)水平。
　　(4)給予20μM CdCl2處理TM3細(xì)胞不同的時間(4h,8h)后收集細(xì)胞，采用western blot和RT-PCR法檢

3、測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白和mRNA的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：(1)不同濃度的鎘(0μM,5μM,10μM,20μM,40μM)處理4h后，5μM、10μM和20μM組細(xì)胞的存活率與同一時間點(diǎn)對照組比較沒有差異，40μM組細(xì)胞的存活率明顯低于同一時間點(diǎn)對照組(p<0.01)；不同濃度的鎘(0μM,5μM,10μM,20μM,40μM)處理8h后，5μM組細(xì)胞的存活率與同一時間點(diǎn)對照組比較略有降低，10μM、20μM和40μM組細(xì)胞的存活率

4、與同一時間點(diǎn)對照組明顯降低(p<0.01)；不同濃度的鎘(0μM,5μM,10μM,20μM,40μM)處理12h、16h、24h后，各處理組細(xì)胞的存活率均低于同一時間，并具有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系(p<0.01)。
　　(2)給予20μM CdCl2處理TM3細(xì)胞不同的時間(4h,8h)，鎘處理組細(xì)胞上清睪酮含量明顯低于對照組睪酮含量(p<0.01)；鎘處理組TM3細(xì)胞的StAR、P450scc和17β-HSD mRNA的表達(dá)水平與

5、對照組比降低(p<0.05, p<0.01)，且顯著下調(diào)鎘處理組TM3細(xì)胞StAR、P450scc、3β-HSD、P45017α和17β-HSD的蛋白的表達(dá)水平(p<0.05, p<0.01)。
　　(3)給予20μM CdCl2處理TM3細(xì)胞不同的時間(4h,8h)，顯著誘導(dǎo)鎘處理組TM3細(xì)胞HO-1蛋白和mRNA的表達(dá)水平，并具有明顯的時間效應(yīng)關(guān)系(p<0.01)；然而鎘處理對TM3細(xì)胞HO-2的蛋白表達(dá)沒有明顯的影響；鎘處理

6、8h組SOD1、SOD2、SOD3、GSH-Px及CAT的mRNA表達(dá)水平與對照組的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05, p<0.01)。
　　(4)給予20μM CdCl2處理TM3細(xì)胞不同的時間(4h,8h)，顯著性上調(diào)鎘處理組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78蛋白和mRNA的表達(dá)，具有明顯的時間效應(yīng)關(guān)系(p<0.01)；此外，鎘顯著誘導(dǎo)GRP94 mRNA表達(dá)，也具有明顯的時間效應(yīng)關(guān)系(p<0.05, p<0.01)，提示ATF6信號

7、通路被激活。鎘處理顯著誘導(dǎo)TM3細(xì)胞PERK蛋白的磷酸化水平(p<0.01)；鎘處理明顯增加TM3細(xì)胞eIF2α蛋白的磷酸化水平，具有時間效應(yīng)關(guān)系(p<0.05, p<0.01)；此外，CHOP的蛋白表達(dá)水平在鎘處理組也明顯增加，并且隨鎘處理的時間延長，誘導(dǎo)作用更加明顯(p<0.01)，提示PERK信號通路被激活。鎘處理誘導(dǎo)TM3細(xì)胞IRE1α蛋白的磷酸化水平，具有明顯的時間效應(yīng)關(guān)系(p<0.05, p<0.01)；此外，鎘處理組JNK