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文檔簡介
1、研究背景:牙周病是牙列缺失、牙列缺損的主要病因之一,而吸煙是牙周病發(fā)生的重要致病因素。目前,吸煙人群牙周病發(fā)生的分子機制尚不清楚。本研究以煙草中最重要的致病因素之一—尼古丁為研究對象,采用細胞術的方法,對尼古丁的細胞毒性和作用機制進行了研究,為牙周病的預防提供理論依據(jù)。
目的:⑴確證尼古丁對人PDLFs的細胞毒性;⑵探討尼古丁對PDLFs的細胞毒性機制,以進一步明確相關信號轉(zhuǎn)導通路所起的作用,為牙周病的預防和治療奠定分子研
2、究基礎。
方法:培養(yǎng)人PDLFs細胞,采用四甲基偶氮唑藍(Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)和流式細胞術(Flow cytometry,F(xiàn)CM)觀察不同濃度的尼古丁對PDLFs的細胞生長增殖抑制情況,對細胞周期的影響情況,以及分析細胞凋亡率的變化,從而分析尼古丁對PDLFs的毒性作用。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(Reverse transcription polymerase chain react
3、ion,RT-PCR)檢測尼古丁干預PDLFs細胞24h后,相關凋亡蛋白PI3K、AKT、Bcl-2和Bax的mRNA水平;激光共聚焦顯微鏡測定細胞內(nèi)Ca2+熒光強度;Western Blotting免疫印跡法檢測尼古丁作用PDLFs后,凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3的蛋白表達水平。根據(jù)RT-PCR、Western Blotting和激光共聚焦顯微鏡測定的實驗結(jié)果,分析尼古丁對牙周的細胞毒性作用中的信號轉(zhuǎn)導機制。
結(jié)果:①
4、尼古丁對人PDLFs的細胞毒性不同濃度的尼古丁(10000μg/ml、1000μg/ml、100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml和0.01μg/m1)作用于PDLFs細胞24 h、48 h和72h后,均能抑制PDLFs細胞的生長。隨著尼古丁濃度的增加,A490值逐漸減小;并且時間越長,A490值也逐漸減小。尼古丁作用PDLFs細胞48h后,G0G1期比例逐漸增高,而S期和G2期的比例則呈下降趨勢(P<0.05)
5、。AnnexinV-FITC/PI雙標記結(jié)合流式細胞儀分析顯示:尼古丁實驗組分別作用于PDLFs細胞作用48h后,各實驗組細胞均出現(xiàn)凋亡,根據(jù)凋亡率排序為:1000μg/ml尼古丁實驗組>10μg/ml尼古丁實驗組>0.1μg/ml尼古丁實驗組。說明尼古丁對PDLFs細胞有增殖抑制作用、細胞周期阻遏作用和促凋亡作用。②尼古丁對PDLFs細胞線粒體信號通路的影響尼古丁作用于PDLFs細胞24h后,細胞內(nèi)Ca2+熒光強度顯著增加,且隨著尼古
6、丁劑量的增加,細胞內(nèi)Ca2+熒光強度值隨之增高(r=0.747、F=41.333、P=0.000);Bcl-2的mRNA表達水平與正常對照組比較顯著下調(diào),而Bax的表達水平上調(diào),且隨著劑量的增加細胞內(nèi)Bcl-2轉(zhuǎn)錄隨之降低(r=0.851、F=80.014、P=0.000),而Bax轉(zhuǎn)錄隨之增高(r=0.961、F=341.270、P=0.000);Caspase3基因轉(zhuǎn)錄增加,且隨著尼古丁劑量的增加,Caspase3的基因轉(zhuǎn)錄呈逐漸增
7、高趨勢(r=0.935、F=318.371、P=0.000)。同時,Caspase3蛋白表達增加,且隨著尼古丁劑量的增加,Caspase3蛋白的翻譯水平表達呈逐漸增高趨勢(r=0.677、F=8.459、P=0.016)。說明尼古丁可引起PDLFs細胞外Ca2+內(nèi)流,胞內(nèi)[Ca2+]增加,Bcl-2基因表達顯著減低而Bax的表達水平上調(diào),引起Cyt C釋放,PDLFs細胞凋亡發(fā)生。③PI3K/Akt信號通路在尼古丁致PDLFs凋亡中的保
8、護作用不同濃度的尼古丁作用于PDLFs細胞24h后,PI3K的表達水平上調(diào),且隨著劑量的增加,PI3K的基因表達水平呈逐漸增高趨勢(r=0.675、F=8.379、P=0.016);Akt的表達水平下調(diào),且隨著尼古丁劑量的增加,Akt的基因表達水平呈逐漸降低趨勢(r=0.989、F=442.819、P=0.000);Akt在各實驗組Thr308、Ser473位點磷酸化磷酸化顯著高于對照組(P<0.01);Caspase3基因轉(zhuǎn)錄增加,且
9、隨著尼古丁劑量的增加,Caspase3的基因轉(zhuǎn)錄呈逐漸增高趨勢(r=0.935、F=318.371、P=0.000)。同時,Caspase3蛋白表達增加,且隨著尼古丁劑量的增加,Caspase3蛋白的翻譯水平表達呈逐漸增高趨勢(r=0.677、F=8.459、P=0.016)。說明PI3K/Akt參與了尼古丁誘導的PDLFs細胞凋亡的過程,并且發(fā)揮了抑制凋亡發(fā)生的作用,但是尼古丁誘導的PDLFs細胞凋亡的促進因素的作用效果強于PI3K/
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