人參總甙對(duì)雙酚A細(xì)胞毒性效應(yīng)的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 隨著環(huán)境污染加劇，如大量的環(huán)境雌激素的使用，人類(lèi)生殖功能呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。人參總甙具有改善生殖功能的效應(yīng)，但對(duì)其機(jī)制研究報(bào)告較少。支持細(xì)胞又稱(chēng)為“nursing”cell，對(duì)雄性生殖具有重要意義，本研究擬觀(guān)察人參總甙對(duì)雙酚A引起15P-1 sertoli cells毒性效應(yīng)的保護(hù)作用，并探究其機(jī)制。
　　 方法：
　　 小鼠睪丸支持細(xì)胞（15p-1 sertoli cell）培養(yǎng)于含10％胎牛血清的DM

2、EM（高糖）培養(yǎng)基、5％CO2、32℃恒溫培養(yǎng)箱中。在培養(yǎng)基中加入不同濃度的BPA和人參總甙，用MTT法確定最佳作用濃度及作用時(shí)間。然后將細(xì)胞分為：（1）正常對(duì)照組；（2）雙酚A誘導(dǎo)組，培養(yǎng)基中加入終濃度為100μM的雙酚A；（3）人參總甙預(yù)處理+雙酚A組，細(xì)胞經(jīng)75μg/ml的人參總甙預(yù)處理24小時(shí)后，加入終濃度100μM的雙酚A；（4）人參總甙處理組，加入75μg/ml的人參總甙。采用倒置顯微鏡及電子顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)，免疫熒光染色

3、法觀(guān)察細(xì)胞骨架蛋白Vimentin的表達(dá)，MTT法及Annexin-V/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞增殖率及凋亡率。用Q-PCR法和Western blotting法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞ClusterinmRNA和蛋白表達(dá)情況。采用Western blotting法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白bcl-2、bax及磷酸化的ERK1/2、JNK、p38表達(dá)水平。用FRAP等法分別檢測(cè)各組細(xì)胞總抗氧化能力（Total Antioxidant Ca

4、pacity，T-AOC）及丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、還原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）、總超氧化物歧化酶（Total SuperoxideDismutase，SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GPx）、谷胱甘肽還原酶（Glmathione Reductase，GR）的水平。以Clusterin為靶向基因，構(gòu)建3個(gè)干擾質(zhì)粒。用脂質(zhì)體法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，Q-P

5、CR及Western blotting法鑒定質(zhì)粒的干擾效率。雙酚A和人參總甙分別處理Clusterin干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的支持細(xì)胞，用Western blotting法檢測(cè)Clusterin蛋白表達(dá)水平，用MTT法及流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞增殖率和凋亡率。
　　 結(jié)果：
　　 1、100μM的雙酚A能有效地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，75μg/ml的人參總甙處理24h對(duì)15p-1 sertoli細(xì)胞無(wú)明顯生長(zhǎng)促進(jìn)作用（P>0.05）。

6、>　　 2、100μM的雙酚A處理15p-1 sertoli細(xì)胞24小時(shí)后，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡改變，光鏡下可見(jiàn)支持細(xì)胞由短梭形變狹長(zhǎng)、甚至扭曲，進(jìn)而開(kāi)始脫壁、變圓；電鏡下可見(jiàn)典型的凋亡小體等；流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)凋亡率明顯地上升；免疫熒光染色法分析發(fā)現(xiàn)骨架蛋白Vimentin表達(dá)發(fā)生改變；Clusterine mRNA和蛋白表達(dá)在24小時(shí)內(nèi)呈現(xiàn)先增高后降低的表達(dá)趨勢(shì)；凋亡相關(guān)蛋白bcl-2/bax的值顯著下降；雙酚A作用于15p-1

7、sertoli細(xì)胞4小時(shí)后，磷酸化的。ERK1/2開(kāi)始出現(xiàn)，持續(xù)表達(dá)至24小時(shí)；細(xì)胞內(nèi)MDA水平升高；GSH和GSSG、總SOD、總抗氧化能力、GPx、GR的水平降低。
　　 3、用75μg/ml的人參總甙對(duì)15p-1 sertoli細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理后再加入的雙酚A，光鏡及電鏡下均發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)接近對(duì)照組；凋亡率明顯下降；骨架蛋白Vimentin表達(dá)正常；Clustering mRNA的表達(dá)雖然也呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)，但幅度明顯較

8、的雙酚A組小，且表達(dá)水平始終高于正常組，Clusterin蛋白的雙向改變受抑制，呈現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)；bcl-2/bax的值接近正常；磷酸化的ERK1/2表達(dá)明顯受抑制；MDA水平顯著下降；GSH、總SOD、總抗氧化能力、GPx、GR的水平升高。
　　 4、轉(zhuǎn)染攜帶干擾片段的質(zhì)?？捎行抡{(diào)15p-1 sertoli細(xì)胞Clusterin基因及蛋白的表達(dá)，影響細(xì)胞正常增殖，并使得雙酚A誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率升高。人參總甙可上調(diào)轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒的支持

9、細(xì)胞Clusterin蛋白表達(dá)，并提高細(xì)胞增殖率。
　　 結(jié)論：
　　 1、雙酚A可通過(guò)MAPK信號(hào)通路、擾亂細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)及擾亂Clusterin的穩(wěn)定表達(dá)，對(duì)15p-1 sertoli細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性效應(yīng)。
　　 2、人參總甙可抑制雙酚A的細(xì)胞毒性作用。其機(jī)制可能是通過(guò)降低磷酸化的ERK1/2水平，增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力，穩(wěn)定特異蛋白Clusterin的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。人參總甙在保護(hù)生殖系統(tǒng)免遭環(huán)境雌激素雙酚A破