山羊重組促卵泡素（FSH）在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)和穩(wěn)定表達(dá)研究.pdf

1、重組FSH能夠避免天然激素制劑在應(yīng)用過(guò)程中的不足,體外重組表達(dá)FSH為新型激素制劑的生產(chǎn)帶來(lái)了契機(jī). 該研究根據(jù)已克隆的山羊FSHα、β基因cDNA序列,構(gòu)建山羊重組FSH真核表達(dá)載體,在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行了體外瞬時(shí)和穩(wěn)定表達(dá),為重組制劑的研制提供必備條件.構(gòu)建山羊FSHα、β亞基真核表達(dá)載體并在COS-7細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá).以pGEM-T-FSHβ為模板,PCR擴(kuò)增FSHβ基因,通過(guò)載體與目的基因的雙酶切及DNA連接,將FSHβ基因插入到

2、真核表達(dá)載體pcDNA3.0,構(gòu)建成pcDNA-FSHβ.從山羊腦垂體組織中提取總RNA,利用RT-PCR技術(shù)成功擴(kuò)增出FSHα cDNA序列.經(jīng)與pcDNA3.o的酶切連接,構(gòu)建成表達(dá)載體pcDNA-FSHα.兩載體經(jīng)序列測(cè)定表明插入的目的基因序列完全正確.用PolyFect轉(zhuǎn)染試劑將兩載體轉(zhuǎn)入COS-7細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá),用放射免疫檢測(cè)表達(dá)上清和細(xì)胞裂解液,有重組FSH表達(dá),但表達(dá)效率不高.提示要獲得高分泌重組產(chǎn)物,必須將α、β基因插

3、入同一載體共表達(dá).構(gòu)建山羊FSHα、β雙表達(dá)載體,在CHO細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá).設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)和Kozak序列的PCR特異引物,分別以pcDNA-FSHα、pcDNA-FSHβ為模板,PCR擴(kuò)增FSHα、β基因.α、β基因與載體pVITRO-2用限制性內(nèi)切酶酶切、DNA連接酶連接,成功構(gòu)建山羊FSHα、β雙表達(dá)載體pVITRO-FSHαβ.基因序列測(cè)定表明插入序列完全正確.載體用PolyFect轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,經(jīng)潮霉素B抗性篩選,獲

4、得穩(wěn)定表達(dá)山羊FSH的CHO細(xì)胞.提取穩(wěn)定表達(dá)的CHO細(xì)胞基因組DNA,PCR檢測(cè),表明山羊FSHα、β基因穩(wěn)定整合到CHO基因組中.培養(yǎng)上清FSH放射免疫檢測(cè),發(fā)現(xiàn)有重組FSH的分泌. 該實(shí)驗(yàn)首次成功構(gòu)建了山羊FSHα、β真核表達(dá)載體pcDNA-FSHα、pcDNA-FSHβ及雙表達(dá)載體pVITRO-FSHαβ;在COS-7和CHO細(xì)胞中得到了表達(dá),并獲得了穩(wěn)定表達(dá)山羊FSH的CHO細(xì)胞.為重組FSH制劑生產(chǎn)及長(zhǎng)效激素的研究奠定了基礎(chǔ)