FGL-NS-Exendin-4緩釋體系的構(gòu)建及促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)的研究.pdf

1、本文分為以下幾個部分:
　　第一部分:FGL-NS/Exendin-4緩釋體系的構(gòu)建、材料性質(zhì)檢測及釋放規(guī)律研究
　　目的:構(gòu)建FGL-NS/Exendin-4緩釋體系并研宄其材料特性及釋放規(guī)律。
　　方法:多肽分子RADA16-I、RADA-FGL、Exendin-4合成，并采用高效液相色譜儀及質(zhì)譜儀分析純化。CCK-8細(xì)胞毒性檢測，確定Exendin-4的細(xì)胞毒性范圍。RADA16-I和RADA-FGL溶液按照1:

2、1比例混合后，PBS觸發(fā)自組裝，構(gòu)建FGL-NS自組裝多肽支架材料；將Exendin-4混合后，P B S觸發(fā)自組裝，構(gòu)建Exendin-4濃度為200n M的FGL-NS/Exendin-4緩釋體系。肉眼觀察自組裝凝膠材料的外形。原子力顯微鏡(Atomic Force Microscope，AFM)檢測FGL-NS及FGL-NS/Exendin-4緩釋體系微納米結(jié)構(gòu)。流變儀（Rheomete)檢測FGL-NS及FGL-NS/Exend

3、in-4流變學(xué)性能。體外釋放實(shí)驗(yàn)分別檢測2％FGL-NS/Exendin-4、1%FGL-NS/Exendin-4及0.5%FGL-NS/Exendin-4緩釋體系對Exendin-4的釋放規(guī)律，評估釋放后Exendin-4的結(jié)構(gòu)及功能變化。
　　結(jié)果:RADA16-I、RADA-FGL、Exendin-4的相對分子量分別為1712.78、3458.74及4584.16Da,純度分別為：98.2%、96.1%、98.6%。AFM檢

4、測證實(shí)，F(xiàn)GL-NS/Exendin-4緩釋體系自組裝后能夠形成具有納米網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)的水凝膠。流變儀檢測顯示，F(xiàn)GL-NS/Exendin-4為具有粘彈性的水凝膠。體外釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，1%FGL-NS/Exendin-4緩釋體系無明顯爆釋現(xiàn)象，30天累計(jì)釋放可達(dá)79%，釋放后Exendin-4的結(jié)構(gòu)無明顯改變，仍具有較好的生物活性。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建FGL-NS/Exendin-4緩釋體系，Exendin-4對FGL-NS的自

5、組裝過程無明顯影響，能夠?qū)崿F(xiàn)對Exendin-4的緩釋調(diào)控，釋放后Exendin-4的結(jié)構(gòu)及生物功能無明顯改變。
　　第二部分:FGL-NS/Exendin-4緩釋體系的生物相容性及神經(jīng)保護(hù)作用研究
　　目的:探索FGL-NS/Exendin-4緩釋體系和神經(jīng)細(xì)胞的生物相容性，研宄其促進(jìn)軸突生長、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用及具體機(jī)制。
　　方法:制備1%FGL-NS/Exendin-4緩釋體系后，CCK-8細(xì)胞毒性試劑盒檢測材

6、料的生物相容性。提取原代背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，將其接種到1%F G L-N S及1%FGL-NS/Exendin-4緩釋體系表面，免疫熒光染色后，觀察材料對神經(jīng)軸突生長的影響，并進(jìn)行定量分析。體外采用缺血缺氧模型（Oxygen and glucose deprivation，OGD)模擬脊髓損傷后的缺血缺氧環(huán)境，驗(yàn)證1%FGL-NS/Exendin-4緩釋體系對P C12細(xì)胞的保護(hù)效果。流式細(xì)胞儀檢測實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞凋亡、線粒體膜電位及活性氧（R

7、eactive oxygen species，ROS)的變化。同時，激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位及活性氧的變化。Western Blot檢測細(xì)胞內(nèi)Akt、p-Akt、ERK、p-ERK、cyto c、cleaved caspase3、Bax及Bcl-2的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:PC12細(xì)胞在1%FGL-NS及1%FGL-NS/Exendin-4培養(yǎng)3天后，細(xì)胞無明顯死亡；背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)3天后，和F G L-N S相比，

8、FGL-NS/Exendin-4能夠顯著促進(jìn)其軸突生長。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)GL-NS/Exendin-4能夠通過抑制P C12細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生及保護(hù)線粒體，顯著減少OGD誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡；激光共聚焦顯微鏡觀察到FGL-NS/Exendin-4干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位升高，R O S產(chǎn)生減少；Western Blot檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)GL-NS/Exendin-4能夠抑制cleaved caspase3及B a x的表達(dá)，上

9、調(diào)B c l-2的表達(dá)，減少線粒體內(nèi)的cyto c釋放到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)；并且FGL-NS/Exendin-4能夠激活PI3K/Akt通路，采用LY294002抑制A k t通路后能夠部分抵消FGL-NS/Exendin-4的抗凋亡效應(yīng)。
　　結(jié)論:FGL-NS/Exendin-4緩釋體系對細(xì)胞無明顯毒性，具有較好的生物相容性；能夠顯著促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞軸突的延長。FGL-NS/Exendin-4緩釋體系能夠通過激活細(xì)胞內(nèi)PI3K/Akt通路，

10、抑制線粒體途徑介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。
　　第三部分:FGL-NS/Exendin-4緩釋體系修復(fù)大鼠脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:建立大鼠脊髓損傷鈍性損傷模型，F(xiàn)GL-NS/Exendin-4緩釋體系植入到大鼠脊髓損傷區(qū)域，探討FGL-NS/Exendin-4緩釋體系修復(fù)脊髓損傷的效果及作用機(jī)制。
　　方法:水合氯醛麻醉S D大鼠后，暴露T10節(jié)段脊髓；采用Model I I型脊髓打擊儀制作大鼠脊髓損傷模型。本實(shí)驗(yàn)分為假手

11、術(shù)組、單純脊髓損傷組和脊髓損傷后1%FGL-NS/Exendin-4干預(yù)實(shí)驗(yàn)組，損傷后24h，將12M L等滲葡萄糖溶液（單純脊髓損傷組）和1%FGL-NS/Exendin-4(FGL-NS/Exendin-4組）植入到大鼠脊髓損傷區(qū)域。術(shù)后1w、2w、3w、4w、5w、6w、7w和8w，采用B B B評分評估各組大鼠脊髓損傷后后肢運(yùn)動功能恢復(fù)情況；術(shù)后8周取材，HE染色評估脊髓損傷區(qū)域空洞形成情況；免疫熒光染色及Western Blo

12、t定量分析，脊髓損傷區(qū)域GFAP、NF、Iba-1、TNF-a的表達(dá)變化，評估脊髓損傷區(qū)域軸突再生、膠質(zhì)瘢痕形成及炎癥反應(yīng)的情況；Western Blot檢測脊髓損傷區(qū)域凋亡標(biāo)志性分子cleaved caspase3及P I3K/A k t通路相關(guān)蛋白p-Akt、A k t分子的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:成功建立S D大鼠鈍性脊髓損傷模型。BBB評分結(jié)果顯示，脊髓損傷4周后FGL-NS/Exendin-4緩釋體系能夠促進(jìn)大鼠后肢運(yùn)動功

13、能恢復(fù)；脊髓損傷8周后，染色結(jié)果顯示，F(xiàn)GL-NS/Exendin-4緩釋體系能夠顯著減少脊髓損傷后空洞的形成；免疫熒光染色顯示，F(xiàn)GL-NS/Exendin-4干預(yù)后脊髓損傷區(qū)域及周圍N F陽性神經(jīng)元顯著增加，G F A P染色陽性細(xì)胞減少及空洞面積減??；Western B l o t定量結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，和單純脊髓損傷組相比，F(xiàn)GL-NS/Exendin-4干預(yù)后脊髓損傷區(qū)域神經(jīng)纖維N F的含量增加，膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白GFAP表達(dá)減少

14、。脊髓損傷1周后，免疫熒光染色檢測損傷區(qū)域的炎癥反應(yīng)，結(jié)果顯示I b a-1陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞數(shù)量顯著減少；Western B l o t定量結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)FGL-NS/Exendin-4干預(yù)后脊髓損傷區(qū)域小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性分子Iba-1的表達(dá)下降，炎癥因子TNF-a釋放減少。脊髓損傷后5天，Western Blot定量分析脊髓損傷局部凋亡相關(guān)分子cleaved caspase3的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GL-NS/Exendin-4干預(yù)