嗅鞘細(xì)胞移植聯(lián)合GDNF-PLGA緩釋微球修復(fù)脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分
　　 目的：
　　 制備新型大鼠脊髓T10全橫斷損傷動物模型，為脊髓損傷(spinalcordinjurySCI)研究提供通用的動物模型。
　　 方法：
　　 雌性成年SD大鼠20只隨機(jī)分為兩組：對照組(n=10)及脊髓損傷組(SCI組，n=10)。SCI組咬除T7-T9棘突及相應(yīng)椎板，采用顯微操作技術(shù)造模，顯微剪橫切斷暴露的T10節(jié)段背側(cè)脊髓，保留腹側(cè)硬膜，再用眼科15度側(cè)切刀完成脊髓完全橫斷

2、，用11/0顯微縫合線縫合硬脊膜和蛛網(wǎng)膜，對照組僅行椎板切除術(shù)。給予術(shù)后截癱護(hù)理并觀察后肢運(yùn)動情況，進(jìn)行BBB運(yùn)動功能評分，動物存活8周以上。取材前1周在脊髓橫斷處尾側(cè)注射熒光金(fluorogold，F(xiàn)G)進(jìn)行逆行標(biāo)記，術(shù)后第8周末取材進(jìn)行組織學(xué)檢測大腦皮質(zhì)體感區(qū)FG標(biāo)記神經(jīng)元。
　　 結(jié)果：
　　 SCI組所有動物在術(shù)后均表現(xiàn)出典型的脊髓截癱癥狀，BBB運(yùn)動功能評分很低，術(shù)后1周為0分，術(shù)后8周能恢復(fù)到7～8分，與對

3、照組相比具有非常顯著性差異(<0.01)。熒光金逆行追蹤分析顯示SCI組大腦皮質(zhì)體感區(qū)未檢測到熒光金標(biāo)記陽性細(xì)胞。
　　 結(jié)論：
　　 建立的新型大鼠脊髓全橫斷損傷模型，硬脊膜保持完整，效果穩(wěn)定，可復(fù)制性強(qiáng)，制作簡便，易于護(hù)理。
　　 第二部分
　　 目的：
　　 研究嗅鞘細(xì)胞移植聯(lián)合膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GlialCellLine-derivedNeurotrophicFactorGDNF)

4、乳酸／羥基乙酸共聚物(polylactic-co-glycolicacid，PLGA)緩釋微球蛛網(wǎng)膜下腔途徑注射對大鼠橫斷性脊髓損傷的修復(fù)作用。
　　 方法：
　　 ①以聚乳酸一羥基乙酸共聚物(polylactide-co-glycolide，PLGA)為包裹材料，采用復(fù)乳法(W1/O/W2)制備GDNF-PLGA微球，使用掃描電鏡及激光粒度分布儀觀察微球形態(tài)并測定其粒徑分布；測定微球載藥量、包封率等指標(biāo)；②采用18h單

5、次差速貼壁的方法純化培養(yǎng)嗅鞘細(xì)胞，定期在倒置顯微鏡下觀察嗅鞘細(xì)胞的形態(tài)及生長情況，并對其行NGFRp75及PI的免疫熒光鑒定，同時(shí)計(jì)算嗅鞘細(xì)胞的純度；③成年雌性SD大鼠60只，建立Tl0脊髓全橫斷損傷模型，隨機(jī)分成6組：單純對照組（10只）、嗅鞘細(xì)胞(OECs)移植組(10只)、GDNF組(10只)、GDNF-PLGA緩釋微球組（10只）、嗅鞘細(xì)胞移植聯(lián)合GDNF組(10只)和嗅鞘細(xì)胞移植聯(lián)合GDNF-PLGA緩釋微球組（10只）。④于

6、大鼠脊髓損傷術(shù)后每周行BBB運(yùn)動功能評分；取材前l(fā)周在脊髓橫斷處尾側(cè)注射熒光金(fluorogold，F(xiàn)G)進(jìn)行逆行標(biāo)記，術(shù)后第8周末取材進(jìn)行組織學(xué)檢測大腦皮質(zhì)體感區(qū)FG標(biāo)記神經(jīng)元；應(yīng)用NF200免疫組化染色觀察脊髓損傷的修復(fù)情況，并采用免疫組化圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。
　　 結(jié)果：
　　 ①采用復(fù)乳法制備的GDNF-PLGA緩釋微球，其表面光滑圓整，無粘連成塊，微球大小較均勻，粒徑分布較窄，微球載藥量為0.046％，

7、、包封率為84.72％;②通過18h單次差速貼壁法純化培養(yǎng)的嗅鞘細(xì)胞純度可達(dá)70％-80％;③BBB運(yùn)動功能評分：術(shù)后8周，6組大鼠后肢運(yùn)動均出現(xiàn)不同程度的恢復(fù)，GDNF組與對照組、OECs組與OECs+GDNF組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其余各組兩兩比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。④熒光金逆行示蹤分析顯示，OECs移植聯(lián)合GDNF-PLGA緩釋微球組、OECs組及OECs移植聯(lián)合GDNF組在大鼠大腦皮質(zhì)體感區(qū)可檢測到熒光金標(biāo)記的陽性錐體細(xì)胞，推

8、測脊髓損傷側(cè)的皮質(zhì)脊髓束發(fā)生了再生并穿越橫斷性病灶達(dá)到了脊髓尾側(cè)，但是對照組、GDNF組未見，GDNF-PLGA微球組僅偶見極個(gè)別的FG標(biāo)記的陽性細(xì)胞；⑤NF200免疫組化結(jié)果及圖像分析顯示：GDNF組與對照組、OECs組與OECs+GDNF組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對照組、GDNF-PLGA緩釋微球組、OECs組以及OECs+GDNF-PLGA緩釋微球組兩兩相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 OE