預測mmu-miR-30a調控糖皮質激素受體及二者在小鼠足細胞上的表達.pdf

1、第一部分
　　 應用生物信息學預測GR mRNA是mmu-miR-30a的可能靶基因
　　 目的：預測miRNA靶基因是否為糖皮質激素受體(Glucocorticoid Receptor，GR) mRNA。
　　 方法：使用miRBase(http://www.mirbase.org)獲得miR-30a基因序列；使用Pubmed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)獲得基因NR3C1序列；分別

2、使用miRanda、TargetScan、PicTar生物信息學軟件對mmu-miR-30a的靶基因進行尋找與預測。
　　 結果：miRanda、TargetScan和PicTar均預測到mmu-mir-30a的靶基因為糖皮質激素受體(Glucocorticoid Receptor，GR)mRNA。
　　 結論：GR mRNA是mmu-miR-30a的可能靶基因
　　
　　 第二部分
　　 小鼠

3、足細胞中GRα及mmu-miR-30a的表達變化
　　 目的：探討GRα與mmu-miR-30a在小鼠足細胞系MPC5(mouse podocyte clone5，MPC5)中的表達變化。
　　 方法：
　　 條件永生型小鼠足細胞系MPC5培養(yǎng)：將復蘇MPC5細胞于33℃中增殖培養(yǎng)，平均3～4天達90％以上融合傳代。換于37℃中培養(yǎng)，10～14天分化為成熟，此時為分化態(tài)MPC5;將以上兩種細胞分為兩組，通過反轉錄

4、酶-聚合酶鏈反應(RT-PCR)、免疫蛋白印跡(Western-blot)、免疫熒光顯微鏡檢測Nephrin、Synaptopodin、GRα在未分化態(tài)與分化態(tài)MPC5中的表達，觀察變化：通過實時熒光定量PCR反應(qRT-PCR)檢測mmu-miR-30a在未分化態(tài)與分化態(tài)MPC5中的表達，觀察變化；
　　 結果：
　　 MPC5細胞在33℃有γ-INF的1640培養(yǎng)液中生長，細胞體小而突起，細胞間排列緊密，呈鵝卵石樣

5、，部分區(qū)域有管腔樣結構，足突樣結構少見，平均3～4天即達到90%融合，在37℃無γ-INF條件培養(yǎng)下的足細胞較33℃的胞體透明，呈多角形，細胞間相對疏松，管腔樣結構增多，生長速度明顯減緩，3～4天后細胞即停止增殖，1周后星型細胞樣細胞形成，樹枝狀的足突結構明顯，可見細胞間足突互相接觸，10～14天分化成熟。RT-PCR、Western-blot、免疫熒光顯微鏡顯示，nephrin在33℃未分化足細胞和37℃分化足細胞中均有表達，37℃分

6、化足細胞中表達顯著增加(P＜0.01);Synaptopodin在33℃未分化足細胞中幾乎未見表達；而在37℃分化足細胞中表達明顯(P＜0.01)。GRα在33℃未分化足細胞和37℃分化足細胞中均有表達，37℃分化足細胞中表達顯著增加(P＜0.01)；qRT-PCR檢測顯示，mmu-miR-30a在33℃未分化足細胞和37℃分化足細胞中均有表達，37℃分化足細胞中表達顯著增加(P＜0.01)。
　　 結論：
　　 GRα