去整合素Echistatin RGD模體定點(diǎn)突變對(duì)其功能的影響及相應(yīng)蛋白質(zhì)基因工程新藥研究.pdf

1、去整合素(disintegrin)是一類來(lái)源于蛇毒蛋白的小分子量蛋白質(zhì)，這類蛋白質(zhì)在氨基酸序列上有高度的相似性，它們均由49～84個(gè)氨基酸組成，序列中含有8～14個(gè)半胱氨酸(cystine)，形成4～7對(duì)二硫健，都含有一個(gè)RGD(Arg-Gly-Asp)環(huán)(loop)，這些蛋白質(zhì)利用其RGD序列和整合素(integrin)結(jié)合，因而競(jìng)爭(zhēng)性的抑制整合素和相應(yīng)配體的結(jié)合，使得整合素的功能被抑制。基于去整合素可以與相關(guān)整合素(αⅡbβ3、αv

2、β3、α5β1等)發(fā)生特異結(jié)合，從而阻斷由整合素介導(dǎo)的多種生理病理反應(yīng)，近年來(lái)已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)，特別是在抑制血栓形成、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、抑制新生血管的生成、防治骨質(zhì)疏松等領(lǐng)域。越來(lái)越多的人們開(kāi)始致力于去整合素藥物的研究與開(kāi)發(fā)。如何選擇合適的去整合素作為研究對(duì)象，開(kāi)發(fā)新一代抗栓、抗癌藥物是許多研究機(jī)構(gòu)多年來(lái)一直努力和奮斗的目標(biāo)，作為分子量較小的Echistatin以其活性高、免疫原性小成為主要研究對(duì)象。 但是，由于去整合素主要

3、是通過(guò)其RGD序列識(shí)別αⅡbβ3、αvβ3等多種整合素從而發(fā)揮作用。而αⅡbβ3主要存在于活化的血小板上，αvβ3主要表達(dá)于新生血管內(nèi)皮細(xì)胞和破骨細(xì)胞上，在多種腫瘤細(xì)胞上也有表達(dá)，因此去整合素介導(dǎo)的生物效應(yīng)作用廣泛但不特異。盡管去整合素獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征理論上可以治療多種相關(guān)疾病，但從臨床治療考慮，我們?nèi)匀幌Ｍ軌虻玫叫再|(zhì)特異，作用專一的去整合素藥物。目前已有研究發(fā)現(xiàn)去整合素中RGD周圍序列的不同會(huì)影響其作用的選擇性，但具體機(jī)制并不清楚。近

4、年來(lái)發(fā)現(xiàn)含有KGD(Lys-Gly-Asp)的去整合素更傾向于結(jié)合整合素αⅡbβ3，選擇性抑制αⅡbβ3的功能，但對(duì)αvβ3，α5β1結(jié)合能力較弱；另外，在研究不同去整合素的結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)RGD環(huán)較寬時(shí)，對(duì)αIIbβ3的結(jié)合能力增強(qiáng)，這些發(fā)現(xiàn)為去整合素結(jié)構(gòu)和功能研究提供了新的思路。 實(shí)驗(yàn)室自上世紀(jì)90年代中期開(kāi)始研究Echistatin，并取得了一定突破，隨著對(duì)多種去整合素研究的不斷深入，本世紀(jì)初，我們將研究重點(diǎn)放在去整合素結(jié)

5、構(gòu)與功能的研究上，課題組根據(jù)不同去整合素中RGD/KGD與目的肽段的結(jié)合特征，適當(dāng)改變EchistatinRGD周圍的部分氨基酸序列，研究其突變體與相應(yīng)整合素結(jié)合及功能的變化，并根據(jù)其功能開(kāi)發(fā)相應(yīng)基因工程藥物，這項(xiàng)研究若能順利實(shí)施，無(wú)疑會(huì)填補(bǔ)我國(guó)在該領(lǐng)域研究的空白，即使與國(guó)外同類藥物相比，也將會(huì)具有多種技術(shù)優(yōu)勢(shì)。首先我們根據(jù)Barbourin含有KGD的結(jié)構(gòu)提出對(duì)Echistatin中的RGD進(jìn)行突變，使其變?yōu)镵GD；繼而根據(jù)RGD環(huán)變

6、寬時(shí)結(jié)合αⅡbβ3能力增強(qiáng)的特點(diǎn)將第27位氨基酸突變?yōu)閃，突變后的RGD模體及周邊序列變?yōu)锳KGDWM，然后利用基因工程技術(shù)對(duì)Echistatin(AKGDWM)進(jìn)行制備，探索該突變體的生物學(xué)功能，開(kāi)發(fā)活性更高，作用更特異的抗血栓藥物;其次，根據(jù)rhodostomin突變體特異結(jié)合αvβ3的特點(diǎn)，將EchistatinRGD模體及周邊序列突變?yōu)锳RGDNM，探索該突變體的生物學(xué)功能，開(kāi)發(fā)作用更加特異的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物。 1.Ec

7、histatin(AKGDWM)基因工程新藥上游工藝標(biāo)準(zhǔn)化體系研究本部分主要探索Echistatin(AKGDWM)原核表達(dá)體系的構(gòu)建，包括Echistatin(AKGDWM)單獨(dú)表達(dá)體系和融合蛋白表達(dá)體系構(gòu)建，并優(yōu)化表達(dá)條件，通過(guò)比較，建立并確定Echistatin(AKGDWM)上游制備工藝的標(biāo)準(zhǔn)化體系，為下游工藝奠定基礎(chǔ)。 2.Echistatin(AKGDWM)基因工程新藥下游工藝標(biāo)準(zhǔn)化體系研究主要探索Echistat

8、in(AKGDWM)突變體下游制備工藝的標(biāo)準(zhǔn)化研究，包括工程菌高密度發(fā)酵工藝的探索和優(yōu)化，目的蛋白分離純化工藝研究與優(yōu)化，并最終建立Echistatin(AKGDWM)下游工藝標(biāo)準(zhǔn)化體系。 3.Echistatin(AKGDWM)基因工程新藥藥效學(xué)研究主要對(duì)課題組制備的Echistatin(AKGDWM)突變體進(jìn)行藥效學(xué)研究，包括：體外抗血小板聚集活性的檢測(cè)，血小板聚集量效和時(shí)效關(guān)系研究，血栓形成抑制實(shí)驗(yàn)及CAM新生血管抑制實(shí)

9、驗(yàn)研究，以期探討其蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。 在Echistatin(AKGDWM)對(duì)ADP活化的體外血小板聚集抑制實(shí)驗(yàn)中，得出血小板聚集的IC50約為60.42nM，低于天然Echistatin抑制血小板聚集的IC50(130nM)。 在血小板聚集量效關(guān)系研究中，Echistatin突變前后抑制聚集活性均呈劑量依賴關(guān)系，在相同劑量下，突變體Echistatin(AKGDWM)抑制血小板聚集活性高于天然Echistati

10、n；在抑制血小板聚集時(shí)效關(guān)系研究中，給藥40min，Echistatin抑制作用已經(jīng)下降，而突變后的Echistatin(AKGDWM)在160min時(shí)尚有60％的活性。在抑制血栓形成實(shí)驗(yàn)中也得到了相同的結(jié)論。 4.Echistatin(ARGDNM)基因工程上游工藝標(biāo)準(zhǔn)化體系研究課題組根據(jù)rhodostomin突變體特異結(jié)合αvβ3的特點(diǎn)，通過(guò)定點(diǎn)突變EchistatinRGD模體周邊序列，使其突變?yōu)锳RGDNM，根據(jù)已經(jīng)建

11、立的Echistatin(AKGDWM)突變體生產(chǎn)工藝(見(jiàn)第一篇內(nèi)容)，建立Echistatin(ARGDNM)突變體基因工程新藥上游生產(chǎn)工藝標(biāo)準(zhǔn)化體系。 5.Echistatin(ARGDNM)基因工程下游工藝標(biāo)準(zhǔn)化體系研究課題組建立的Echistatin(AKGDWM)工程菌發(fā)酵工藝、融合蛋白分離純化工藝是經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)摸索，優(yōu)化多種條件的基礎(chǔ)上建立并加以完善形成的。我們應(yīng)用已經(jīng)建立的高密度發(fā)酵工藝和分離純化工藝(參見(jiàn)前述E

12、chistatin(AKGDWM)基因工程新藥下游工藝標(biāo)準(zhǔn)化體系研究)，對(duì)Echistatin(ARGDNM)突變體工程菌進(jìn)行高密度發(fā)酵，并應(yīng)用DEAE陰離子交換層析分離純化融合蛋白，獲得了較高的細(xì)菌得率(112g/L)和較高的蛋白產(chǎn)量(每克濕菌獲突變體蛋白約19.23mg)。因此Echistatin(ARGDNM)突變體下游工藝的研究完全可以參照Echistatin(AKGDWM)突變體的下游工藝，這不僅說(shuō)明了先前建立的基因工程上下游

13、工藝的穩(wěn)定性和可靠性，而且利用一套成熟的基因工程制備體系制備生產(chǎn)兩種(包括Echistatin有三種)蛋白，體現(xiàn)了經(jīng)濟(jì)節(jié)約的原則，這既符合大規(guī)模生產(chǎn)新藥的技術(shù)要求，也最大限度的降低了生產(chǎn)成本。為類似多肽類藥物的研究與開(kāi)發(fā)提供了思路和方法。 6.Echistatin(ARGDNM)基因工程新藥藥效學(xué)研究主要對(duì)課題組制備的Echistatin(ARGDWM)突變體進(jìn)行藥效學(xué)研究，其內(nèi)容與前面設(shè)計(jì)的藥效內(nèi)容一致。經(jīng)過(guò)比較，Echis

14、tatin(ARGDWM)突變體抑制血小板聚集的IC50為226.03nM，抑制CAM血管新生的IC50為8.69nM，這一研究結(jié)果證實(shí)了突變后的Echistatin(ARGDWM)更傾向于結(jié)合αvβ3，識(shí)別并結(jié)合αIIbβ3的能力下降，這為后續(xù)臨床前研究奠定了基礎(chǔ)，對(duì)于研究與開(kāi)發(fā)作用更加特異、療效更加確切的去整合素藥物具有重要的指導(dǎo)意義。 7.Echistatin(AKGDWM)突變體多順?lè)醋釉舜?lián)表達(dá)體系構(gòu)建本部分根據(jù)原

15、核生物mRNA多順?lè)醋拥奶攸c(diǎn)，以Echistatin(AKGDWM)DNA序列為例，通過(guò)在目的基因5’端設(shè)計(jì)SD間隔序列和起始密碼ATG，在目的基因3端設(shè)計(jì)終止密碼TAA(或TAG)。在每一順?lè)醋忧霸O(shè)計(jì)合適酶切位點(diǎn)使目的基因以三拷貝串聯(lián)方式排列，每一拷貝都有獨(dú)立的起始密碼和終止密碼，拷貝之間有設(shè)計(jì)的SD間隔序列，探索通過(guò)設(shè)計(jì)SD間隔序列，利用串聯(lián)方式對(duì)小分子多肽進(jìn)行高效表達(dá)，以期解決小分子多肽難以單獨(dú)高效表達(dá)的問(wèn)題，為開(kāi)發(fā)利用小分子多肽