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文檔簡介
1、蛋白質(zhì)生物活性的調(diào)控在人類健康和疾病治療中具有重要的意義。如何精確地控制蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和活性等生物學(xué)性能是解決其在疾病治療、分子診斷和組織工程等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用問題的關(guān)鍵。利用聚合物對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改性從而提高蛋白質(zhì)性能的研究受到越來越廣泛的關(guān)注。聚合物與蛋白質(zhì)表面的定點(diǎn)結(jié)合可以得到結(jié)構(gòu)可控的蛋白質(zhì)-聚合物偶聯(lián)物,其中聚合物的性質(zhì)以及在蛋白質(zhì)表面的引入位點(diǎn)是關(guān)系其最終應(yīng)用性能的重要因素。
本論文的主要工作是制備多種功能性聚合物定點(diǎn)
2、改性的蛋白質(zhì),系統(tǒng)研究聚合物的種類及其與蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)對(duì)蛋白質(zhì)生物學(xué)性能的影響。具體研究內(nèi)容如下:
首先,制備了一系列不同位點(diǎn)處含有巰基的模型蛋白質(zhì)。通過基因重組的方法獲得了野生型無機(jī)焦磷酸酶(PPase),通過基因定點(diǎn)突變的方法在PPase表面特定位點(diǎn)處引入半胱氨酸殘基,制備了一系列在不同位點(diǎn)處含有巰基的突變型PPase,并最終作為聚合物定點(diǎn)結(jié)合的蛋白質(zhì)模型。通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)表征表達(dá)純化的PP
3、ase及其突變體的純度,通過測定PPase催化焦磷酸鈉水解生成正磷酸鹽的含量表征PPase及其突變體的活性,通過Ellman法測定PPase及其突變體的自由巰基含量。結(jié)果表明:通過突變基因的構(gòu)建以及突變體蛋白質(zhì)的表達(dá)純化我們獲得了純度極高的突變體蛋白質(zhì),并成功在蛋白質(zhì)表面的不同位點(diǎn)處引入一個(gè)可自由反應(yīng)的巰基,突變型PPase的活性與突變位點(diǎn)的位置和氨基酸殘基種類有關(guān),但總體來說,雖然活性有一定的變化,但這種變化并不會(huì)對(duì)其后續(xù)的研究產(chǎn)生重
4、要的影響,因此獲得的突變體蛋白質(zhì)可以用于下一步研究。
然后,制備了生物相容性聚合物聚甲基丙烯酸羥乙酯(pHEMA)與 PPase的偶聯(lián)物,研究了pHEMA的引入對(duì)蛋白質(zhì)活性和構(gòu)象的影響,并與小分子巰基修飾試劑對(duì)氯汞苯甲酸(PCMB)對(duì)蛋白質(zhì)的影響進(jìn)行了比較。利用吡啶二硫基功能化的原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)引發(fā)劑引發(fā)ATRP聚合制備末端基團(tuán)功能化的pHEMA;通過核磁共振氫譜(1HNMR)和凝膠滲透色譜(GPC)對(duì)聚合物的分
5、子量以及分子量分布進(jìn)行表征;通過吡啶二硫基功能化pHEMA與靠近活性中心特定位點(diǎn)處含有巰基的突變型PPase(PPaseK148C)之間的化學(xué)結(jié)合將pHEMA偶聯(lián)到PPase活性中心附近;通過SDS-PAGE和動(dòng)態(tài)光散射(DLS)表征PPase-pHEMA偶聯(lián)物的形成;通過活性測定研究PCMB和pHEMA的引入對(duì)PPase活性的影響;通過還原劑的還原處理研究 pHEMA和 PCMB對(duì) PPase活性的可逆調(diào)控;通過圓二色譜(CD)對(duì) P
6、CMB和pHEMA偶聯(lián)前后PPase的構(gòu)象變化進(jìn)行表征。結(jié)果表明:PCMB和pHEMA在PPase表面的引入可以抑制蛋白質(zhì)的活性,而 pHEMA的引入對(duì)蛋白質(zhì)活性的抑制程度更大。這種抑制作用可以通過不同還原劑的處理而得以消除。并且,這種 PCMB和pHEMA偶聯(lián)對(duì)PPase活性的抑制以及還原劑處理對(duì)活性的恢復(fù)具有明顯的可逆性。PCMB和pHEMA對(duì)蛋白質(zhì)活性的影響是由于其造成了蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。與小分子 PCMB相比,聚合物pHEM
7、A的結(jié)合對(duì)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的改變更大。還原劑對(duì)PPC-PCMB和PPC-pHEMA偶聯(lián)物活性的恢復(fù)是由于其引起PCMB和pHEMA從蛋白質(zhì)表面的解離,從而使得蛋白質(zhì)的構(gòu)象得以恢復(fù)。這一蛋白質(zhì)活性調(diào)節(jié)的策略有望應(yīng)用于生物檢測、藥物釋放以及細(xì)胞功能調(diào)節(jié)等領(lǐng)域。
其次,制備了pH響應(yīng)性聚合物聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯(pDMAEMA)與PPase的偶聯(lián)物,并研究了pDMAEMA在蛋白質(zhì)表面不同位點(diǎn)處的引入對(duì)蛋白質(zhì)活性和pH穩(wěn)定性
8、的影響。通過可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移(RAFT)聚合合成不同分子量的pDMAEMA并利用二硫二吡啶后修飾的方法實(shí)現(xiàn)其末端基團(tuán)的吡啶二硫基功能化;通過1HNMR和GPC對(duì)聚合和后修飾反應(yīng)進(jìn)行表征;通過pDMAEMA末端吡啶二硫基團(tuán)與突變型 PPase表面巰基之間的結(jié)合分別將聚電解質(zhì) pDMAEMA偶聯(lián)到 PPase表面靠近活性中心(PPaseK148C)以及遠(yuǎn)離活性中心(PPaseN124C)的特定位點(diǎn);通過Native PAGE表征PPas
9、e-pDMAEMA偶聯(lián)物的形成;通過不同pH條件下偶聯(lián)物的粒徑和Zeta電勢表征pDMAEMA的引入對(duì)PPase電荷狀態(tài)和聚集狀態(tài)的影響。結(jié)果表明:pDMAEMA在蛋白質(zhì)表面不同位點(diǎn)處的引入對(duì)其活性具有不同的影響??拷钚灾行臅r(shí)蛋白質(zhì)活性受到較為嚴(yán)重的影響,而遠(yuǎn)離活性中心時(shí)對(duì)蛋白質(zhì)活性的影響較小,且在酸性pH下的活性有一定程度的提高。不同分子量pDMAEMA在蛋白質(zhì)表面遠(yuǎn)離活性中心位點(diǎn)處的引入均能提高蛋白質(zhì)在酸性環(huán)境中的活性,聚合物分子
10、量越大活性提高的程度越大。pDMAEMA對(duì)蛋白質(zhì)活性的影響是由于其改變了蛋白質(zhì)的表面電荷狀態(tài)。聚合物的引入有效防止了蛋白質(zhì)在pH為4.0到6.0范圍內(nèi)的聚集,使得蛋白質(zhì)在酸性環(huán)境下的活性顯著提高。這種在蛋白質(zhì)表面特定位點(diǎn)處引入聚電解質(zhì)鏈的方法為提高蛋白質(zhì)在極端pH條件下的穩(wěn)定性提供了新策略。
最后,制備了糖聚物聚丙烯酰胺基葡萄糖(pAG)和聚甲基丙烯酰胺基葡萄糖(pMAG)與PPase的偶聯(lián)物,研究和比較了兩種不同類型和分子量
11、的糖聚物對(duì)蛋白質(zhì)表面不同位點(diǎn)的修飾對(duì)蛋白質(zhì)活性的影響。通過 RAFT聚合的方法制備兩種糖聚物pAG和pMAG;通過二硫二吡啶后修飾的方法將糖聚物末端基團(tuán)轉(zhuǎn)化成吡啶二硫基團(tuán);通過1HNMR和GPC對(duì)聚合和后修飾反應(yīng)進(jìn)行表征;通過糖聚物pAG和pMAG吡啶二硫基團(tuán)與突變型PPase巰基之間的化學(xué)偶合分別將pAG和pMAG偶聯(lián)到PPase表面靠近活性中心(PPaseK148C)以及遠(yuǎn)離活性中心(PPaseN124C)的特定位點(diǎn),通過SDS-P
12、AGE表征PPase-糖聚物偶聯(lián)物的形成。結(jié)果表明:糖聚物在蛋白質(zhì)表面的引入位點(diǎn)對(duì)其活性具有極其重要的影響,靠近活性中心結(jié)合時(shí)蛋白質(zhì)活性降低,遠(yuǎn)離活性中心結(jié)合時(shí)蛋白質(zhì)活性提高。對(duì)于同種糖聚物pAG,分子量不同時(shí)對(duì)蛋白質(zhì)的活性影響也有所不同??拷钚灾行臅r(shí)分子量較大的糖聚物降低蛋白質(zhì)活性的程度較大,而遠(yuǎn)離活性中心時(shí)分子量較小的糖聚物提高蛋白質(zhì)活性的程度較大。分子量相當(dāng)?shù)牟煌蔷畚飌AG和pMAG對(duì)蛋白質(zhì)活性的影響沒有顯著差異。這一結(jié)果對(duì)蛋
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