功能性聚合物的定點修飾對增強蛋白質穩(wěn)定性的研究.pdf

1、蛋白質作為生物體內不可或缺的組成成分，不僅是專一高效的催化劑，而且可作為用于疾病的診斷和治療的活性藥物。雖然蛋白質在生物學反應，酶工程，分子生物學以及臨床治療中應用廣泛，但由于蛋白質自身結構的復雜性和脆弱性往往在復雜的應用環(huán)境中表現出較差的穩(wěn)定性和生物學活性，使得蛋白質的應用受到了一定的限制。如何有效提高蛋白質在復雜環(huán)境中的活性及穩(wěn)定性迫在眉睫，同時也是拓寬蛋白質應用范圍的關鍵問題所在。其中利用聚合物對蛋白質進行修飾從而提高蛋白質的性能

2、得到越來越多科研工作者的關注。
　　為此，本論文利用可逆加成斷裂鏈轉移（RAFT）聚合以及合成化學制備出一系列不同類型、不同鏈長且末端帶有吡啶二硫酯基團的功能性聚合物，與蛋白質無機焦磷酸酶（PPase）上特定位點突變的半胱氨酸巰基進行反應制備得到聚合物-蛋白質偶聯物，系統(tǒng)地研究了聚合物-蛋白質偶聯物在不同環(huán)境因子改變的條件下的生物活性及穩(wěn)定性，并進一步探討了聚合物-蛋白質偶聯物在生物催化反應和生物醫(yī)學中的應用。具體研究內容如下：<

3、br>　　首先，利用基因定點突變技術在PPase活性中心附近的148位賴氨酸殘基突變成半胱氨酸殘基，構建了無機焦磷酸酶單點突變體 K148C，并與 RAFT聚合制備獲得的不同鏈長的聚 N-異丙基丙烯酰胺（ PNIPAM）結合形成偶聯物PNIPAM-PPase。溫敏性聚合物PNIPAM的修飾使得PPase的溫度耐受閾值顯著提高，其最適反應溫度由未修飾酶的45℃提升至60℃；同時，蛋白質的高溫耐受能力和熱穩(wěn)定性也明顯改善，當修飾的PNIPA

4、M分子量達到66000時，偶聯物在60℃C下孵育3小時，其活性保留有77％左右，是未修飾酶的6.8倍。研究結果顯示了偶聯物 PNIPAM-PPase在高溫條件下優(yōu)異的溫度耐受性和熱穩(wěn)定性，為蛋白質在體外不利的高溫條件下保持較高的生物活性和穩(wěn)定性提供了新的研究策略。
　　然后，我們進一步探討了偶聯物PNIPAM-PPase在生物酶催化反應中的應用。聚合酶鏈式反應（PCR）是分子生物學和基因工程的關鍵技術，在生物工程與臨床診斷中至關重

5、要。但因該反應副產物焦磷酸根（PPi）的積累會阻礙反應向正方向的順暢進行，使得反應效率降低。而傳統(tǒng)分解PPi的方法無法適應PCR長時間的高溫反應條件。因此，我們將制備的PNIPAM-PPase偶聯物引入到PCR反應中，通過分解PCR反應過程中生成的PPi，在不影響反應特異性的情況下，使得PCR反應效率提高了1.5倍，達到顯著促進PCR的效果。不僅如此，偶聯物在PCR的高溫且長時間循環(huán)的反應環(huán)境中仍能保持很高的分解PPi的活性，當循環(huán)次數

6、達到100次時，偶聯物能保留大約78%的活性。該策略為實現蛋白質在不利的高溫環(huán)境下保持有效的生物學活性和穩(wěn)定性提供了可行的途徑和有意義的探索。
　　最后，考慮到PNIPAM為外源性聚合物存在生物相容性的問題，在體內應用方面可能存在一定的限制，因此我們進一步地探究聚糖的修飾對蛋白質的生物學活性的影響。通過相同的策略制備糖聚物-蛋白質偶聯物從而模擬糖蛋白。我們利用甲基丙烯酰氯與氨基葡萄糖的酰胺化反應制備出一種乙酰氨基葡萄糖（GlcNA

7、c）的單體類似物甲基丙烯酰胺葡萄糖（MAG），并通過RAFT聚合制備了一系列不同分子量的糖聚物（PMAG）。利用定點突變技術獲得突變體N124C，制備出糖蛋白類似物（PMAG-PPase）。糖聚物的引入極大地提高了蛋白質的活性，且表現為較小分子量的糖聚物顯示出較高的活性，當修飾的分子量為8000的PMAG時，蛋白質的活性提高至14.12±0.66 kat/kg。不僅如此，與天然糖蛋白效果類似，偶聯物在較強酸堿溶液，高鹽溶液以及蛋白酶等復

8、雜條件下同樣表現出優(yōu)異的穩(wěn)定性；與此同時，得益于糖聚物獨特的C-C主鏈結構，PMAG-PPase能夠有效避免天然糖蛋白所無法避免的糖苷酶的降解，顯示了其獨特的優(yōu)勢。而且，通過蛋白質自身能夠有效分解PPi的特點，PMAG-PPase能夠有效水解焦磷酸鈣，從而在治療焦磷酸鈣沉積?。–PDD）：類痛風這一疑難雜癥中具有巨大的潛力。這種糖蛋白類似物在生物檢測和臨床治療中顯示出極高的價值。
　　綜上所述，通過定點修飾的方式構建了一系列不同類