高脂血癥大鼠種植體早期骨結(jié)合界面的微觀分析及分子機(jī)制探究.pdf

1、目的:
　　研究高脂血癥大鼠種植體早期骨結(jié)合界面的微觀形態(tài)和微觀成分，并探究其與Dishevelled-2(DVL2)相關(guān)的可能的分子機(jī)制。
　　方法:
　　(1).Wistar大鼠60只，均為雄性，依照隨機(jī)原則，分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別以高脂飼料和普通飼料喂養(yǎng)。
　　(2).12周后，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組大鼠血脂水平，去除實(shí)驗(yàn)組中不符合高脂血癥標(biāo)準(zhǔn)的大鼠以及對(duì)照組中血脂異常的大鼠。在全麻下分別將一枚種植體植入，兩組大鼠左右

2、兩側(cè)股骨干骺端。在種植體植入后的1天、3天和5天分別處死一批大鼠，取出含有種植體的骨組織（圖1），分別進(jìn)行不同的檢測(cè)。
　　(3).種植體植入后1天和5天的標(biāo)本固定包埋后制作硬組織切片，分別進(jìn)行光學(xué)顯微鏡和和掃描電鏡(scanning electronic microscopy, SEM)觀測(cè)，分析種植體早期骨結(jié)合界面的微觀形態(tài)的動(dòng)態(tài)變化。光學(xué)顯微鏡觀測(cè)種植體周圍的成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和骨小梁;SEM進(jìn)一步在高倍鏡下，觀測(cè)種植體周圍

3、的成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和骨質(zhì)狀況。
　　(4).種植體植入后1天和5天的標(biāo)本固定包埋后制作硬組織切片，在種植體中部1/3，沿種植體向組織方向，以10μm為間隔依次選“1～6”六個(gè)微區(qū)（圖2），通過X射線能譜儀（energy dispersive X-ray spectrometer, EDS）分析種植體早期骨結(jié)合界面的微觀成分的動(dòng)態(tài)變化，進(jìn)行鈣、磷、氧和鈦元素定量測(cè)定;計(jì)算Ca/P原子個(gè)數(shù)百分比。
　　(5).1天、3天和5天

4、的標(biāo)本，一部分液氮凍存通過熒光定量PCR(relativefluorescence quantitative polymerase chain-reaction，RT-PCR)檢測(cè)種植體周圍1mm骨組織中DVL2基因的表達(dá)情況;另外一部分，迅速提取蛋白，通過Western Bolt檢測(cè)種植體周圍1mm骨組織中DVL2蛋白和磷酸化的DVL2蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　(1).光學(xué)顯微鏡分析發(fā)現(xiàn)，種植體植入后的1～5d，種

5、植體周圍的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞逐漸增多。實(shí)驗(yàn)組骨質(zhì)疏松，骨小梁稀疏、排列紊亂;對(duì)照組骨質(zhì)致密。實(shí)驗(yàn)組種植體周圍的成骨細(xì)胞少于對(duì)照組（P＜0.05），破骨細(xì)胞多于對(duì)照組(P＜0.05)。
　　(2).SEM觀測(cè)到的結(jié)果與光學(xué)顯微鏡相似，在種植體植入后的1～5 d，種植體周圍的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞逐漸增多。實(shí)驗(yàn)組骨質(zhì)疏松，對(duì)照組骨質(zhì)致密。實(shí)驗(yàn)組種植體周圍的成骨細(xì)胞少于對(duì)照組，破骨細(xì)胞多于對(duì)照組。
　　(3).實(shí)驗(yàn)組Ca/P原子個(gè)數(shù)百

6、分比低于對(duì)照組（P＜0.05），O元素的原子百分比高于對(duì)照組（P＜0.05）;由種植體至骨組織Ti元素的原子百分比逐漸減少，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各取樣微區(qū)內(nèi)的Ti元素原子百分比無明顯差異。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的“5、6”取樣微區(qū)的Ca/P原子個(gè)數(shù)百分比，均隨時(shí)間的增加而減少，并且“5”取樣微區(qū)的Ca/P原子個(gè)數(shù)百分比略小于“6”取樣微區(qū)的Ca/P原子個(gè)數(shù)百分比;“4”取樣微區(qū)的Ca/P原子個(gè)數(shù)百分比，隨種植體植入時(shí)間的增加而略增加。“1、2、3”取

7、樣微區(qū)均未檢測(cè)到Ca、P元素。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的“5、6”取樣微區(qū)的O元素原子百分比，隨種植體植入時(shí)間的增加而略增加，并且“5”取樣微區(qū)的O元素原子百分比大于“6”取樣微區(qū)的O元素原子百分比;“4”取樣微區(qū)的O元素原子百分比，隨種植體植入時(shí)間的增加而略微減少。“1、2、3”取樣微區(qū)均未檢測(cè)到O元素。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的“6”取樣微區(qū)未檢測(cè)到Ti元素，“1、2、3、4、5”取樣微區(qū)的Ti元素原子百分比逐漸減少，“4、5”取樣微區(qū)的Ti元素原子百

8、分比，表現(xiàn)出隨種植體植入時(shí)間的增加而稍減少的趨勢(shì);“1、2、3”取樣微區(qū)的Ti元素原子百分比，隨種植體植入時(shí)間的增加而略增加。
　　(4).實(shí)驗(yàn)組的DVL2基因的表達(dá)水平不及對(duì)照組（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組DVL2的mRNA的表達(dá)水平在1-3天呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在3-5天內(nèi)呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)(p＜0.05);對(duì)照組DVL2的mRNA的表達(dá)水平在1-3天以內(nèi)略微上升，在3-5天內(nèi)略微下降。
　　(5).DVL2蛋白的表達(dá)水平與DVL2的

9、mRNA的表達(dá)水平相似。實(shí)驗(yàn)組的DVL2蛋白的表達(dá)水平低于對(duì)照組(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)組DVL2蛋白的表達(dá)水平在1-3天呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在3-5天內(nèi)呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)(p＜0.05);對(duì)照組DVL2蛋白的表達(dá)水平在1-3天以內(nèi)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在3-5天內(nèi)略微下降。
　　(6).實(shí)驗(yàn)組的磷酸化的DVL2蛋白的表達(dá)水平低于對(duì)照組（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組磷酸化的DVL2蛋白的表達(dá)水平在1-3天呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在3-5天內(nèi)呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)(p＜0.0