以丙氨酸消旋酶為靶標(biāo)的中藥抗菌成分的篩選.pdf

1、丙氨酸消旋酶(alanineracemase，Alr)(EC5.1.1.1)是以磷酸吡哆醛(pyridoxal5'-pgosphate，PLP)為輔酶，催化L型丙氨酸向D型丙氨酸轉(zhuǎn)化的酶，而D型丙氨酸參與細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，是細(xì)菌生長所必須的關(guān)鍵成分。丙氨酸消旋酶只廣泛分布在原核生物，而不存在高等真核生物。因而成為研究和開發(fā)新型抗菌藥物的靶標(biāo)。中藥因其資源廣，毒副作用小，不產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)成為藥物篩選的重要資源。以丙氨酸消旋酶為靶標(biāo)，從中

2、藥中篩選丙氨酸消旋酶抑制劑，能夠?qū)ふ覠o毒、低成本的抗菌藥物同時(shí)利于闡明中藥抗菌機(jī)制。
　　 本文以來源于假單胞桿菌YZ26的重組丙氨酸消旋酶His-Alr為靶標(biāo)，首先采用旋光儀測(cè)定中藥材浸出物對(duì)Alr活性的影響，其次用試管倍比稀釋法進(jìn)一步測(cè)定中藥材浸出物對(duì)假單胞桿菌YZ-26生長狀況的影響，對(duì)89種具有抗菌消炎作用的中藥材進(jìn)行篩選。結(jié)果表明，89種中藥中有25種能夠不同程度抑制Alr的活性，除白茅根和陳皮提取物對(duì)假單胞桿菌YZ-

3、26生長沒有抑制作用外，其余23種中藥提取物均能夠抑制YZ-26的生長。以牡丹皮的抑制作用最強(qiáng)為68.3％虎杖次之為54.55％。在培養(yǎng)基中加入D-ala后除牡丹皮、毛冬青、木香外剩余20種中藥浸提物的抑制作用均有所緩解，其中虎杖的緩解作用最為明顯，約為30％。
　　 進(jìn)一步根據(jù)虎杖中各組分溶解性的不同，對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)分離，得到95％乙醇提取物、石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、醇溶組分和醇沉組分;利用旋光法測(cè)定各組分對(duì)

4、Alr活性的影響，結(jié)果顯示，95％乙醇提取物、石油醚提取物、乙酸乙酯提取物及醇沉組分對(duì)Alr均有抑制作用，其中醇沉組分作用最強(qiáng)，抑制率為49.51％.。醇沉組分主要含有多糖和蛋白質(zhì)，用Sevag法除去蛋白質(zhì)后，發(fā)現(xiàn)隨著多糖濃度的增大，其對(duì)Alr的抑制作用也在不斷的增強(qiáng)。因此，虎杖中抑制Alr活性的物質(zhì)為多糖。通過微波輻照氧化降解法將該多糖降解成小分子多糖，并用旋光法測(cè)定其對(duì)丙氨酸消旋酶Alr活性的影響，揭示降解后的虎杖小分子多糖對(duì)丙氨酸

5、消旋酶Alr的活性抑制作用消失。用熒光光譜分析法測(cè)定該多糖對(duì)丙氨酸消旋酶Alr的抑制活性，顯示其半抑制濃度IC50為2.425mg·ml-1。試管倍比稀釋法測(cè)得該多糖對(duì)假單胞桿菌YZ-26生長的半抑制濃度MIC50為0.4925mg·ml-1。
　　 將重組丙氨酸消旋酶的蛋白偶聯(lián)到CNBr活化的Spharose4B柱材料上，然后與虎杖提取物的混合樣品孵育，用旋光儀測(cè)定偶聯(lián)在Spharose4B柱材料上的丙氨酸消旋酶的活性。結(jié)果表