建立基于人PPARs為靶標的藥物篩選細胞平臺.pdf

1、目的:過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)可介導多種物質(zhì)代謝途徑和藥物治療效應。本研究旨在通過PPARs基因載體質(zhì)粒與過氧化物酶體增殖物反應元件(PPRE)報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞,人工模擬PPARs信號通路,通過陽性藥物干預實驗,評價該細胞模型作為藥物篩選新平臺應用的可行性,為進一步篩選具有生物活性的PPARs配體激動劑提供一種新的細胞模型篩選方法。
　　 方法:(1)細胞培養(yǎng)及質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染:用含10％胎牛血清的HG-DM

2、EM于37℃、5％CO2飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)293T細胞。取第3代細胞,按8×104個細胞/孔的細胞密度接種于24孔板中,待細胞生長匯合度達90～95％時,采用陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000進行質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。實驗分為phPPARα-IRES2-EGFP轉(zhuǎn)染組、phPPARγ-IRES2-EGFP轉(zhuǎn)染組和空載體pIRES2-EGFP轉(zhuǎn)染組(對照組),每組均共轉(zhuǎn)染含人PPRE報告質(zhì)粒ptk-PPRE×3-luc(含螢火蟲熒光素酶

3、報告基因)、內(nèi)部對照質(zhì)粒pRL-CMV(含海腎熒光素酶報告基因)。(2)轉(zhuǎn)染效率檢測:轉(zhuǎn)染36h后,采用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白(GFP)表達情況,并用流式細胞術(shù)(FCM)檢測phPPARα-IRES2-EGFP和phPPARγ-IRES2-EGFP質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率。(3)特異性PPARs配體陽性藥物干預293T細胞轉(zhuǎn)染體系:轉(zhuǎn)染14h后,各轉(zhuǎn)染組分別加入1‰DMSO、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5

4、mol/L、10-4mol/L濃度梯度的陽性藥物(phPPARα-IRES2-EGFP轉(zhuǎn)染組選用WY14643,phPPARγ-IRES2-EGFP轉(zhuǎn)染組選用羅格列酮),藥物作用24h后采用雙熒光素酶報告基因檢測法(DLR)檢測雙熒光素酶活性,獲得不同藥物濃度作用下的雙熒光素酶報告基因比值(F/R值),分析陽性藥物作用的量-效關(guān)系;并用10-5mol/L濃度陽性藥物干預實驗進行時-效分析。(4)PPARs藥物篩選細胞平臺特異性鑒定:對上

5、述反應體系交叉更換干預藥物,PPARα反應體系采用羅格列酮,而PPARγ則用WY14643,用以檢測上述體系的特異性。實驗還采用RXRα配體全反式維甲酸(ATRA)代替PPARs陽性藥物,分別對上述反應體系進行干預,以了解上述體系是否可通過全反式維甲酸激動。(5)熒光定量PCR檢測陽性藥物作用后各轉(zhuǎn)染組細胞PPARs及RXRα基因mRNA表達水平。(6)PPARs藥物篩選細胞平臺應用能力評價:采用臨床使用的貝特類降脂藥苯扎貝特、環(huán)丙貝特

6、、氯貝丁酯對建立的PPARα藥物篩選細胞平臺進行應用檢測。
　　 結(jié)果:(1)熒光顯微鏡下phPPARα-LRES2-EGFP和phPPARγ-IRES2-EGFP轉(zhuǎn)染293T細胞呈現(xiàn)綠色熒光;FCM分析結(jié)果顯示,2種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染效率分別達為68.30％和67.56％,熒光顯微鏡觀察GFP報告基因表達強。(2)陽性藥物干預相應293T細胞轉(zhuǎn)染體系的F/R值均具有良好的量-效和時-效關(guān)系,DLR檢測量-效分析結(jié)果:2種人PPAR

7、s基因細胞轉(zhuǎn)染體系的PPRE報告質(zhì)粒熒光素酶報告基因表達水平(F/R值)隨著相應陽性藥物濃度升高而升高,但藥物濃度過高又會抑制其表達F/P,值反而降低(P＜0.01),而空載體pIRES2-EGFP轉(zhuǎn)染組在不同藥物及濃度作用下的F/R值始終呈低值基線狀態(tài):時-效分析結(jié)果:2種人PPARs基因細胞轉(zhuǎn)染體系的PPRE報告質(zhì)粒熒光素酶報告基因表達水平(F/R值)隨著相應陽性藥物作用時間的延長而升高(P＜0.01)。(3)PPARα特異性配體W

8、Y14643不能激動PPARγ轉(zhuǎn)染的293T細胞反應體系,而羅格列酮則可部分激動PPARα轉(zhuǎn)染的293T細胞反應體系,但其反應強度不及WY14643(P＜0.05)。2種PPAR轉(zhuǎn)染細胞體系均不能被全反式維甲酸有效激活。(4)RT-PCR檢測結(jié)果顯示,不同陽性藥物及濃度作用下的phPPARα-IRES2-EGFP轉(zhuǎn)染組293T細胞PPARαmRNA表達水平比空載體對照組高4個數(shù)量級,phPPARγ-IRES2-EGFP轉(zhuǎn)染組293T細胞

9、PPARγmRNA表達水平比空載體對照組高2～3個數(shù)量級,mRNA表達水平提示導入的重組質(zhì)粒能夠高效表達PPARs。而各組RXRotmRNA呈一致性的低水平表達。(5)貝特類降脂藥苯扎貝特、環(huán)丙貝特、氯貝丁酯對建立的PPARα藥物篩選細胞平臺均呈現(xiàn)良好的量-效反應性,但反應強度因3種藥物濃度不同而存在差異(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:成功構(gòu)建了一種新的基于以人PPARs受體為靶標的藥物篩選細胞平臺,為進一步研究PPARs功能和