RhoA-ROCK信號(hào)通路參與酒精誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞屏障通透性增加的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 腸粘膜屏障是機(jī)體重要的免疫防御屏障，將機(jī)體與腸道內(nèi)的外源性物質(zhì)隔離開，避免病原微生物侵襲和抗原分子對(duì)機(jī)體的損傷。腸粘膜屏障包括上皮屏障、免疫屏障和微生物屏障，其中腸上皮屏障是最重要的一道屏障，是腸粘膜具有選擇性通透的基礎(chǔ)。近年來，大量的研究提示酒精可致腸道損傷、腸通透性增加，導(dǎo)致內(nèi)毒素腸滲漏。因此，酒精所致腸道通透性改變的分子機(jī)制備受關(guān)注。
　　 酒精可通過多個(gè)環(huán)節(jié)破壞腸上皮細(xì)胞屏障功能，引起屏障通透性增高

2、，但其具體作用環(huán)節(jié)十分復(fù)雜。乙醇可能通過激活誘生型一氧化氮合成酶(iNOS)，使NO過度產(chǎn)生，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和氧化微管蛋白，從而損害微管細(xì)胞骨架;酒精及其代謝產(chǎn)物乙醛亦可以通過抑制磷酸酪氨酸磷酸酶的活性，誘導(dǎo)細(xì)胞間緊密連接蛋白的重新分布;乙醇可通過改變細(xì)胞膜脂質(zhì)與脂蛋白比例而增加了細(xì)胞膜的流動(dòng)性，導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)大分子物質(zhì)的通透性增加;乙醇可激活肌球蛋白輕鏈激酶(myosinlight-chain kinase，MLCK)，進(jìn)而改變肌動(dòng)蛋白和微

3、管等細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞屏障功能紊亂。RhoA/ROCK信號(hào)通路可通過磷酸化肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，MLC)，引起緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin、ZO-1重分布，緊密連接(tight junction，TJ)開放。且緊密連接作為細(xì)胞間通路最主要的屏障直接影響腸粘膜屏障的通透性。我們應(yīng)用Caco-2細(xì)胞株建立體外腸上皮細(xì)胞屏障模型，觀察乙醇對(duì)腸上皮細(xì)胞屏障通透性增加和腸上皮細(xì)胞間緊密連接的影響，同時(shí)探

4、討RhoA/ROCK信號(hào)通路是否參加酒精誘導(dǎo)腸粘膜屏障通透性增加的過程。
　　 方法：
　　 1、應(yīng)用MTT比色法及LDH法檢測(cè)乙醇對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的影響。
　　 2、體外腸上皮細(xì)胞屏障模型的建立，應(yīng)用Millicell-ERS電阻測(cè)量系統(tǒng)檢測(cè)乙醇作用前后體外跨上皮細(xì)胞電阻值(transepithelial electrical resistance，TEER)的變化;應(yīng)用熒光黃透過率實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)乙醇對(duì)體外腸上皮細(xì)

5、胞屏障通透性的影響。
　　 3、乙醇作用前后及shRNA沉默RhoA基因進(jìn)行預(yù)處理，應(yīng)用pulldown試劑盒檢測(cè)RhoA活性形式RhoA-GTP的表達(dá)變化;應(yīng)用Western blot法檢測(cè)體外腸上皮細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin和ZO-1的蛋白質(zhì)表達(dá)水平;檢測(cè)磷酸化的肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，MLC)和MLC的表達(dá)。應(yīng)用免疫熒光法檢測(cè)乙醇作用前后及shRNA干擾RhoA基因后緊密連接跨膜蛋白o(hù)

6、ccludin的分布。
　　 4、予以Rho激酶(Rho associated kinase，ROCK)特異性抑制劑Y-27632預(yù)處理體外腸上皮細(xì)胞屏障模型，檢測(cè)乙醇作用前后及抑制劑預(yù)處理后TEER值及熒光黃透過率;應(yīng)用Western blot法檢測(cè)體外腸上皮細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin和ZO-1的蛋白質(zhì)表達(dá)水平;檢測(cè)磷酸化的肌球蛋白輕鏈(myosin lightchain，MLC)和MLC的表達(dá)。應(yīng)用免疫熒光染色檢測(cè)

7、乙醇作用前后及ROCK特異性抑制劑Y-27632預(yù)處理后緊密連接跨膜蛋白o(hù)ccludin的分布。
　　 結(jié)果：
　　 1、成功建立了體外腸上皮細(xì)胞屏障模型。
　　 2、MTT比色法檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，乙醇濃度≤5％（體積比）時(shí)，Caco-2細(xì)胞對(duì)照組與乙醇作用后刺激因素組生長(zhǎng)抑制率無顯著差異;乙醇濃度＞5％時(shí)，Caco-2細(xì)胞對(duì)照組與乙醇作用后刺激因素組生長(zhǎng)抑制率存在顯著差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LDH法檢測(cè)證實(shí)，乙醇濃度

8、≤10％時(shí)，Caco-2細(xì)胞對(duì)照組與乙醇作用后刺激因素組無顯著差異。因此我們選擇≤5％乙醇濃度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
　　 3、乙醇作用后，體外腸上皮細(xì)胞屏障模型的TEER值呈濃度-時(shí)間依賴性，隨作用時(shí)間逐漸降低，于60min時(shí)達(dá)最低值，此后逐漸恢復(fù)，5％濃度乙醇作用尤為顯著;熒光黃透過率呈濃度-時(shí)間依賴性，隨作用時(shí)間逐漸增加，于60min時(shí)達(dá)峰值，此后逐漸恢復(fù)，5％濃度乙醇作用尤為顯著。予Y-27632預(yù)處理使TEER值顯著升高，熒光

9、黃透過率顯著降低。
　　 4、乙醇作用后，腸上皮細(xì)胞的RhoA活性顯著升高。予RhoA shRNA干擾后，RhoA的活性顯著降低;相應(yīng)地，乙醇作用后，腸上皮細(xì)胞中的P-MLC表達(dá)顯著升高，予RhoA shRNA干擾后，p-MLC表達(dá)顯著降低;乙醇作用后，腸上皮細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin的可溶性片段(S)與非可溶性片段(IS) IDV比值顯著升高，ZO-1的蛋白表達(dá)顯著降低。熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)緊密連接斷裂、消失。予Rh

10、oA shRNA干擾后，腸上皮細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin的可溶性片段(S)與非可溶性片段(IS) IDV比值顯著降低，ZO-1的蛋白表達(dá)明顯增加。熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)緊密連接跨膜蛋白o(hù)ccludin表達(dá)可部分恢復(fù)。
　　 5、乙醇作用后，腸上皮細(xì)胞中的p-MLC表達(dá)顯著升高，予ROCK特異性抑制劑Y-27632預(yù)處理后，p-MLC表達(dá)顯著降低;乙醇作用后，腸上皮細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin的可溶性片段(S)與非

11、可溶性片段(IS) IDV比值顯著升高，ZO-1的蛋白表達(dá)顯著降低。熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)緊密連接斷裂、消失。予ROCK特異性抑制劑Y-27632預(yù)處理后，腸上皮細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin的可溶性片段(S)與非可溶性片段(IS) IDV比值顯著降低，ZO-1的蛋白表達(dá)顯著增加。熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)緊密連接跨膜蛋白o(hù)ccludin可部分恢復(fù)。
　　 結(jié)論：
　　 1、RhoA/ROCK信號(hào)途徑參與乙醇誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)